A Caccia delle Cellule Spia del Melanoma: Una Nuova Arma dalla Microfluidica per l’Analisi Genetica

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di un argomento che mi appassiona tantissimo e che sta aprendo porte incredibili nella lotta contro il cancro, in particolare contro il melanoma: la biopsia liquida. Immaginate di poter “spiare” il tumore e capire come evolve senza dover ricorrere continuamente a biopsie invasive del tessuto. Fantastico, vero? Beh, non è fantascienza!

Il Problema: Nemici Nascosti e Mutevoli

Il melanoma, sia quello cutaneo (CM) che quello uveale (UM), è un osso duro. Una delle sue caratteristiche più problematiche è l’eterogeneità: all’interno dello stesso tumore, e tra le diverse metastasi, possono coesistere cellule diverse, con caratteristiche genetiche e fenotipiche differenti. Questo rende difficile capire quale sia la “popolazione” cellulare dominante in un dato momento e, soprattutto, quale potrebbe sviluppare resistenza alle terapie. La biopsia tissutale tradizionale, pur essendo il gold standard per la diagnosi, ci dà solo una fotografia parziale e istantanea, spesso non rappresentativa dell’intera malattia e rischiosa se le lesioni sono in punti difficili da raggiungere.

Qui entrano in gioco le Cellule Circolanti di Melanoma (CMC). Sono le cellule che si staccano dal tumore primario o dalle metastasi e viaggiano nel sangue. Sono le vere responsabili della diffusione della malattia, le “seminatrici” di nuove metastasi. Studiarle è fondamentale perché portano con sé le informazioni genetiche e fenotipiche dell’intero panorama tumorale. Il problema? Sono incredibilmente rare (poche cellule in millilitri di sangue!) e, come il tumore da cui originano, sono molto eterogenee, specialmente nei marcatori che esprimono sulla loro superficie. Isolarle e analizzarle è una vera sfida.

Le Tecnologie Attuali e i Loro Limiti

Esistono già delle piattaforme per “catturare” queste cellule. La più nota, approvata dalla FDA, è la CellSearch. Per il melanoma, si basa sulla cattura delle cellule che esprimono un marcatore specifico, il CD146. Diversi studi hanno dimostrato che il numero di queste cellule CD146-positive è correlato alla prognosi dei pazienti. Tuttavia, affidarsi a un singolo marcatore è rischioso: potremmo perderci per strada altre CMC che non esprimono CD146 ma che sono altrettanto importanti, magari perché portatrici di mutazioni che causano resistenza ai farmaci. È un po’ come cercare solo le auto rosse in mezzo al traffico: ne troveremmo molte, ma ci sfuggirebbero tutte quelle di altri colori!

La Nostra Proposta: Un Approccio Innovativo con Parsortix

Proprio per superare questi limiti, nel nostro studio abbiamo deciso di esplorare e ottimizzare un’altra tecnologia promettente: il sistema Parsortix. Anche questo ha ricevuto l’approvazione FDA (per il cancro al seno metastatico) e funziona in modo diverso. Invece di cercare marcatori specifici, sfrutta le caratteristiche fisiche delle cellule tumorali: le CMC sono generalmente più grandi e meno deformabili delle cellule del sangue normali. Il Parsortix è essenzialmente un “filtro” microfluidico che le intrappola in base a queste proprietà, indipendentemente dai marcatori che esprimono (approccio marker-agnostic). Il grande vantaggio? Le cellule vengono recuperate vive e intatte, pronte per qualsiasi tipo di analisi molecolare a valle, inclusa quella genetica.

Il nostro obiettivo era chiaro: testare i punti di forza e di debolezza di entrambe le piattaforme (CellSearch e Parsortix) e vedere se potevamo integrarle per creare un flusso di lavoro (workflow) completo, che andasse dal semplice conteggio delle CMC all’analisi genetica dettagliata.

Mettere a Punto gli Strumenti: Il Cocktail di Anticorpi

Una delle prime cose che abbiamo fatto è stata sviluppare un cocktail personalizzato di anticorpi da usare con Parsortix. Anche se la cattura è basata sulla fisica, dovevamo comunque essere sicuri di identificare correttamente le cellule catturate come CMC e distinguerle da eventuali “contaminanti” (come cellule endoteliali o globuli bianchi). Abbiamo selezionato anticorpi contro diversi antigeni noti del melanoma (CD146, HMW-MAA, MART-1, GP100) e contro marcatori dei leucociti/cellule endoteliali (CD45, CD16, CD34). Dopo vari test, abbiamo trovato le concentrazioni ottimali e verificato che il nostro cocktail funzionasse alla perfezione nel riconoscere le cellule di melanoma all’interno del dispositivo Parsortix, distinguendole efficacemente dalle altre cellule.

Il Confronto: Parsortix vs CellSearch

Abbiamo quindi confrontato le performance di cattura. Utilizzando linee cellulari di melanoma “infiltrate” in campioni di sangue di donatori sani (spike-in), abbiamo visto che Parsortix aveva una capacità di cattura paragonabile a CellSearch, e in alcuni esperimenti addirittura superiore. Ma la vera sorpresa è arrivata con i campioni reali di pazienti con melanoma metastatico. Qui, Parsortix ha dimostrato una capacità di recupero significativamente maggiore rispetto a CellSearch. Questo, secondo noi, è dovuto proprio all’approccio marker-agnostic combinato con il nostro cocktail multi-marcatore, che permette di “vedere” una popolazione più ampia ed eterogenea di CMC.

Inoltre, abbiamo ottimizzato il processo di recupero delle cellule dalla cassetta Parsortix (harvesting), scoprendo che l’aggiunta di BSA (albumina sierica bovina) al buffer migliorava notevolmente il tasso di recupero, portandolo a una media dell’87% (e fino al 96%!), perché impediva alle cellule di attaccarsi alle pareti della cassetta. Un altro vantaggio notevole di Parsortix è stata la minore contaminazione da globuli bianchi (WBC) rispetto a CellSearch, un fattore cruciale per le analisi genetiche successive.

La Doppia Purificazione: Il Meglio di Due Mondi?

Abbiamo anche provato una strategia combinata: prima arricchire le cellule con CellSearch e poi processare il campione risultante con Parsortix. L’idea era di sfruttare la standardizzazione di CellSearch e poi “pulire” ulteriormente il campione con Parsortix. Il risultato? Un campione di CMC quasi completamente puro! Abbiamo calcolato che questo doppio arricchimento ha ridotto la contaminazione da globuli bianchi di ben 220 volte rispetto al solo arricchimento con Parsortix. Questa strategia può essere preziosa quando si necessita della massima purezza per analisi genetiche molto sensibili, come la ricerca di variazioni del numero di copie (CNV).

Il Caso Studio: Decifrare il Genoma delle CMC

La vera prova del nove è arrivata da un paziente con melanoma uveale metastatico in rapida progressione. Questo paziente aveva un numero insolitamente alto di CMC nel sangue, il che lo rendeva il candidato ideale per testare l’intero flusso di lavoro, dall’arricchimento all’analisi genetica.

Abbiamo processato il suo sangue in diversi modi:

• Solo Parsortix (partendo da sangue in EDTA, per cellule vitali)
• Solo Parsortix (partendo da sangue in provette CellSave, con cellule fissate)
• Doppio arricchimento CellSearch + Parsortix

Da ogni campione arricchito, abbiamo estratto il DNA. Una parte l’abbiamo analizzata così com’era (lysed-only), un’altra parte l’abbiamo prima amplificata (con tecniche di Whole Genome Amplification – WGA, necessarie quando si parte da pochissime cellule) e poi analizzata. Abbiamo usato diverse tecniche: Next-Generation Sequencing (NGS) con un pannello personalizzato di geni rilevanti per il melanoma, ddPCR (Digital Droplet PCR) e MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) per validare e approfondire le scoperte. Abbiamo anche analizzato il DNA libero circolante (cfDNA) dello stesso paziente, per avere un quadro ancora più completo.

I risultati sono stati entusiasmanti! Siamo riusciti a identificare diverse alterazioni genetiche chiave tipiche del melanoma uveale:

• La mutazione GNAQ p.Q209L, trovata in omozigosi (entrambe le copie del gene mutate).
• Una delezione nel gene BAP1 (p.R238_V250 delinsM), trovata in emizigosi (persa la copia normale del gene). È interessante notare che questa perdita dell’allele normale di BAP1 sembra essere avvenuta senza la classica perdita del cromosoma 3, suggerendo meccanismi più complessi come la disomia uniparentale.
• La formazione di un isocromosoma 8q (un’alterazione cromosomica associata a prognosi sfavorevole).
• Una delezione omozigote del gene CDKN2A.

Queste alterazioni sono state confermate sia nei campioni lisati che in quelli amplificati, e anche nel cfDNA, soprattutto nel campione prelevato al momento della progressione della malattia. Il confronto tra i campioni lisati e quelli amplificati ci ha anche permesso di identificare alcuni potenziali artefatti introdotti dalla WGA, un’informazione utile per affinare ulteriormente le analisi future. La frequenza allelica molto alta (vicina al 90%) delle mutazioni GNAQ e BAP1 nel campione ottenuto con il doppio arricchimento ha confermato l’eccezionale purezza raggiunta.

Cosa Abbiamo Imparato e Dove Andiamo

Questo studio ci ha dimostrato che è fattibile mettere a punto un flusso di lavoro robusto per arricchire, recuperare e caratterizzare geneticamente le CMC vitali da pazienti con melanoma metastatico, partendo da una piattaforma marker-agnostic come Parsortix e integrandola con un cocktail anticorpale personalizzato. Abbiamo visto che, a seconda dell’obiettivo (solo conteggio, analisi fenotipica, analisi genetica SNV, analisi CNV), si può scegliere la strategia migliore: solo Parsortix, solo CellSearch, o la combinazione delle due.

L’analisi del caso di melanoma uveale ha evidenziato come lo studio delle CMC, integrato con l’analisi del cfDNA, possa fornire un quadro dettagliato del panorama molecolare del tumore e della sua evoluzione nel tempo, anche senza avere a disposizione il tessuto tumorale. Questo apre scenari importantissimi per la medicina personalizzata: monitorare la risposta alle terapie, identificare precocemente l’insorgenza di resistenze e guidare le scelte terapeutiche in tempo reale.

Certo, ci sono ancora dei limiti. Il nostro studio si basa su un numero limitato di pazienti. Inoltre, anche se il doppio arricchimento ci ha dato un campione molto puro, l’ideale sarebbe poter isolare e analizzare singole cellule CMC. Questo ci permetterebbe di studiare l’eterogeneità a un livello ancora più profondo, magari identificando sottocloni rari ma clinicamente rilevanti. Integrare un sistema di micromanipolazione o di selezione cellulare a valle del nostro workflow è sicuramente il prossimo passo da perseguire.

In conclusione, siamo convinti che questo approccio rappresenti un passo avanti significativo. Abbiamo messo a punto e validato degli strumenti potenti per “dare la caccia” e “interrogare” queste cellule spia del melanoma. La strada è ancora lunga, ma la possibilità di decifrare i segreti del tumore direttamente dal sangue dei pazienti è una promessa troppo grande per non continuare a esplorarla con entusiasmo!

Fonte: Springer