Dentro le Vescicole Sinaptiche: Segreti di Invecchiamento e Parkinson Svelati nei Topi

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi in un viaggio incredibile, nel cuore pulsante del nostro cervello, là dove i neuroni comunicano tra loro: le sinapsi. E più precisamente, voglio parlarvi di minuscoli “pacchetti postali” chiamati vescicole sinaptiche (SV). Immaginatele come delle micro-bolle piene zeppe di messaggeri chimici, i neurotrasmettitori. Quando un segnale elettrico arriva alla fine di un neurone (il terminale presinaptico), queste vescicole si fondono con la membrana e rilasciano il loro contenuto, permettendo al segnale di passare al neurone successivo. Un meccanismo fondamentale, vero?

Ma cosa succede a queste vescicole con il passare del tempo, con l’invecchiamento? E cosa succede in malattie neurodegenerative come il Parkinson o altre sinucleinopatie, dove una proteina chiamata alfa-sinucleina (αSyn) gioca un ruolo chiave, spesso proprio legandosi a queste vescicole? Sorprendentemente, nonostante si sappia che circa il 15% delle proteine delle vescicole sinaptiche è collegato a malattie del sistema nervoso centrale e che l’età è il fattore di rischio numero uno per le sinucleinopatie, nessuno aveva mai esplorato a fondo come le SV cambiano con l’età e la malattia. Fino ad ora!

La Sfida: Capire le Vescicole nel Profondo

Capire cosa non va nelle sinapsi è cruciale, perché molti studi suggeriscono che i problemi iniziano proprio lì, molto prima che i neuroni inizino a morire nel Parkinson. Tante proteine legate al Parkinson, inclusa l’αSyn, sono coinvolte nel funzionamento delle sinapsi. Ma studiare questi cambiamenti è complicato. Spesso si usano modelli animali che sviluppano la malattia troppo in fretta, o si analizzano campioni post-mortem, quando la malattia è già avanzata. Questo ci dà poche informazioni sui meccanismi iniziali.

Noi volevamo andare più a fondo. Volevamo “fotografare” le vescicole sinaptiche a livello ultrastrutturale (guardandole al microscopio elettronico), analizzare tutte le loro proteine (proteomica) e tutti i loro lipidi (lipidomica). Un approccio “omico” completo, applicato direttamente alle vescicole!

Per farlo, abbiamo scelto dei modelli murini (topi) molto particolari. Non quelli con mutazioni aggressive che si ammalano subito, ma modelli che mimano meglio la progressione lenta della malattia umana. Abbiamo analizzato topi normali (wild-type, WT) per vedere i cambiamenti dovuti al solo invecchiamento, topi senza alfa-sinucleina (αSynKO, knockout) per capire cosa succede quando manca la sua funzione normale, e topi che esprimono l’alfa-sinucleina umana al posto di quella murina (αSynBAC), con livelli e distribuzione simili a quelli umani, per studiare gli effetti della proteina umana “normale” ma nel contesto dell’invecchiamento. Abbiamo esaminato questi topi a 1 mese (giovani), 3 mesi (adulti) e 10 mesi (maturi).

Sotto la Lente: Cosa Abbiamo Visto?

Ultrastruttura delle Sinapsi: Stabilità e Cambiamenti Specifici

Usando la microscopia elettronica, abbiamo guardato le sinapsi nello striato e nella substantia nigra, aree cerebrali chiave per il movimento e colpite dal Parkinson. Nei topi WT, siamo rimasti colpiti dalla stabilità: fino a 10 mesi, la dimensione dei terminali sinaptici, il numero e la densità delle vescicole, la lunghezza della “zona attiva” (dove avviene il rilascio) rimanevano incredibilmente costanti. L’invecchiamento “normale”, almeno fino a questa età, non sembrava stravolgere la struttura presinaptica.

Ma nei topi αSynKO e αSynBAC, la storia era diversa! Entrambi i gruppi mostravano, con l’età:

• Terminali sinaptici più piccoli.
• Meno vescicole “attraccate” (docked) alla zona attiva, pronte al rilascio.
• Una zona attiva più corta.

Questi risultati suggeriscono problemi nel preparare le vescicole per il rilascio. È interessante notare che i topi αSynKO (senza la proteina) mostravano anche un aumento della densità delle vescicole a 10 mesi, forse un accumulo dovuto a problemi nel ciclo. I topi αSynBAC, invece, mostravano un fenomeno unico: un aumento del clustering delle vescicole, cioè stavano più “appiccicate” tra loro a 10 mesi. Questo è affascinante perché l’αSyn è nota per influenzare proprio il raggruppamento delle vescicole.

Popolazioni di Vescicole: Chi si Muove e Chi Resta?

Abbiamo poi usato tecniche biochimiche per separare le vescicole “libere” da quelle “attraccate” o raggruppate. Nei topi WT, la proporzione tra questi gruppi restava stabile con l’età. Nei topi αSynKO, invece, abbiamo visto un aumento delle vescicole libere e una diminuzione di quelle attraccate/raggruppate con l’età, confermando i dati della microscopia sulla riduzione dell’attracco. Sorprendentemente, nei topi αSynBAC, nonostante l’aumento del clustering visto al microscopio, non abbiamo trovato grandi cambiamenti in queste popolazioni separate biochimicamente. Forse l’aumento del clustering compensa la riduzione dell’attracco in questo modello.

Dentro le Vescicole: Proteine e Lipidi Sotto Esame

Il Proteoma: Un Equilibrio Delicato

Analizzando le proteine totali nel cervello, abbiamo trovato pochi cambiamenti, suggerendo che i problemi sono più specifici a livello sinaptico. Ma quando abbiamo analizzato le proteine direttamente nelle frazioni arricchite di vescicole sinaptiche (crude SVs) con la spettrometria di massa, abbiamo identificato cambiamenti specifici e significativi!

Abbiamo trovato un piccolo gruppo di proteine che cambiava con l’invecchiamento in tutti i topi, legate a:

• Regolazione dell’esocitosi (rilascio): Synaptotagmin-1/2, Syntaxin-1B, Munc18-1, Rab27B, SV2B.
• Acidificazione delle vescicole (per riempirle di neurotrasmettitore).
• Metabolismo dei fosfolipidi: ATP8A1.
• Endocitosi (recupero delle vescicole): Bin1.

Poi c’erano i cambiamenti specifici per genotipo:

• Nei topi αSynKO (senza αSyn): Aumento di proteine legate al clustering (Synapsin 1/2), al priming (CADPS2), al disassemblaggio del complesso SNARE (NSF) e all’endocitosi (AP1B1, Synaptojanin 1). Diminuzione di alcune subunità della pompa protonica vATPase (V0a1, V0d1, V1F1), che potrebbero rallentare il riempimento delle vescicole.
• Nei topi αSynBAC (con αSyn umana): Qui le cose si facevano interessanti! Molti cambiamenti erano opposti a quelli dei topi KO. Diminuzione delle Synapsin 1/2/3, di CADPS2, di AP1B1 e di PICALM (endocitosi). Aumento di altre subunità della vATPase (V0d1, V1F1), forse per accelerare il riempimento.

Questa opposizione tra KO e BAC suggerisce che l’αSyn modula direttamente queste proteine e che sia la sua assenza (perdita di funzione) sia la sua presenza (in forma umana, forse con un guadagno di funzione o semplicemente diversa interazione) alterano l’equilibrio proteico delle vescicole.

Il Lipidoma: La Membrana Parla

E i lipidi? La membrana delle vescicole è fatta di lipidi, e la loro composizione influenza la forma, la fluidità, la curvatura della membrana e le interazioni con le proteine. Abbiamo analizzato per la prima volta in modo sistematico il lipidoma di vescicole sinaptiche purificate. Un lavoro pionieristico!

Abbiamo identificato centinaia di lipidi diversi. Anche qui, i topi WT mostravano pochi cambiamenti con l’età. Ma i topi αSynKO e αSynBAC rivelavano alterazioni significative. La cosa più eclatante?

• Nei topi αSynBAC, il contenuto totale di lipidi per vescicola diminuiva con l’età (a 3 e 10 mesi). Questo significa un rapporto proteina/lipido alterato, che sicuramente impatta le proprietà fisiche della membrana.
• C’erano cambiamenti specifici nelle classi di lipidi. Ad esempio, nei topi αSynBAC aumentavano le ceramidi e i lisofosfolipidi (lysoPC, lysoPS), mentre diminuivano fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolammina (PE).
• Ancora una volta, abbiamo visto tendenze opposte: i topi αSynBAC mostravano un aumento dei lisolipidi (che tendono a indurre curvatura positiva) rispetto ai loro precursori, mentre i topi αSynKO mostravano la tendenza opposta, con più PC, PE e soprattutto fosfatidilserina (PS, importante per interazioni proteiche e membrane planari).

Questi cambiamenti lipidici sono fondamentali! Alterano la curvatura della membrana (importante per fusione ed endocitosi), la sua fluidità e i siti di legame per proteine cruciali, inclusa l’αSyn stessa. L’aumento dei lisolipidi nei topi αSynBAC è particolarmente interessante, perché alterazioni simili sono state viste nel Parkinson umano e potrebbero facilitare il legame dell’αSyn alla membrana o alterarne la funzione.

Cosa Significa Tutto Questo? La Perdita di Funzione Conta!

Mettendo insieme tutti i pezzi – ultrastruttura, proteine, lipidi – emerge un quadro affascinante e complesso. L’invecchiamento “normale” (fino a 10 mesi nei topi) sembra avere un impatto limitato sulla struttura e composizione base delle vescicole sinaptiche. Tuttavia, la presenza di αSyn umana (anche a livelli fisiologici) o la sua completa assenza inducono cambiamenti specifici e progressivi con l’età.

Questi cambiamenti toccano punti nevralgici del ciclo delle vescicole:

• Clustering e Mobilizzazione: Alterazioni nelle sinapsine e nei lipidi influenzano come le vescicole sono raggruppate e rese disponibili.
• Attracco e Priming: Riduzione delle vescicole attraccate, zone attive più corte e cambiamenti in proteine come CADPS2 suggeriscono problemi nel preparare le vescicole alla fusione.
• Fusione/Rilascio: Cambiamenti in proteine come Synaptotagmin, Munc18-1, Syntaxin-1B e nella composizione lipidica potrebbero alterare l’efficienza del rilascio.
• Riempimento: Alterazioni nella vATPase potrebbero influenzare quanto neurotrasmettitore viene caricato in ogni vescicola.
• Endocitosi/Riciclo: Modifiche in proteine come AP1B1, Bin1, PICALM, Synaptojanin 1 e nei lipidi potrebbero rendere il recupero delle vescicole meno efficiente.

La scoperta forse più sorprendente è quanto fossero pronunciati i cambiamenti nei topi αSynKO, quelli senza alfa-sinucleina. Questo suggerisce fortemente che la perdita della funzione normale di αSyn contribuisce significativamente alla disfunzione sinaptica. Per anni, la ricerca sul Parkinson si è concentrata sul “guadagno di funzione tossica” dell’αSyn aggregata. I nostri dati dicono: attenzione, anche la mancanza della sua funzione fisiologica è un problema serio! Questo è importante perché nel cervello dei pazienti con Parkinson, gran parte dell’αSyn solubile potrebbe essere “sequestrata” negli aggregati, portando di fatto a una perdita di funzione a livello della sinapsi.

Verso il Futuro

Il nostro studio fornisce una mappa dettagliata, una sorta di “atlante” dei cambiamenti che avvengono nelle vescicole sinaptiche durante l’invecchiamento e in modelli rilevanti per le sinucleinopatie. È una base fondamentale per future ricerche che dovranno capire esattamente come questi cambiamenti proteici e lipidici impattano la funzione sinaptica e se sono causa o conseguenza della malattia.

Certo, ci sono limiti: abbiamo analizzato il cervello intero, mentre sarebbe interessante vedere le differenze tra aree specifiche o tipi di neuroni. E l’analisi lipidomica non ci dice come i lipidi sono distribuiti tra i due strati della membrana. Ma questo è solo l’inizio!

Quello che abbiamo imparato è che le vescicole sinaptiche sono incredibilmente dinamiche e sensibili sia all’invecchiamento sia alla presenza (o assenza) dell’alfa-sinucleina. Capire a fondo questa “danza” molecolare all’interno delle nostre sinapsi è una chiave essenziale per svelare i meccanismi di malattie come il Parkinson e, speriamo, per trovare nuove strade terapeutiche che non si limitino a contrastare la tossicità degli aggregati, ma che mirino anche a ripristinare la funzione sinaptica perduta. Un’avventura scientifica appena iniziata!

Fonte: Springer