Superbatteri KO? La Nostra Arma Segreta Digitale Contro Pseudomonas aeruginosa

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di una sfida che ci tiene svegli la notte nel mondo della ricerca medica: la lotta contro i cosiddetti “superbatteri”. E in particolare, voglio raccontarvi come stiamo cercando di mettere all’angolo uno dei più temibili: lo Pseudomonas aeruginosa.

Un Nemico Insidioso Chiamato Pseudomonas

Magari il nome Pseudomonas aeruginosa non vi dice molto, ma credetemi, è un osso duro. È un batterio Gram-negativo che si trova praticamente ovunque e occupa il terzo posto sul podio dei responsabili delle infezioni ospedaliere, subito dopo lo Staphylococcus aureus e l’Escherichia coli. Il problema grosso è che questo batterio è diventato un maestro nell’arte di resistere agli antibiotici. Molti dei farmaci che usiamo comunemente, come la penicillina e gran parte dei beta-lattamici, gli fanno un baffo. Certo, alcuni antibiotici come piperacillina, ciprofloxacina, tobramicina e imipenem funzionano ancora, ma la resistenza è in aumento vertiginoso [2, 4].

Questo batterio è particolarmente pericoloso per persone con difese immunitarie basse, pazienti con ustioni, infezioni urinarie o malattie polmonari come la fibrosi cistica [3]. E come se non bastasse, è un campione nel creare biofilm, una specie di scudo protettivo che lo difende dal nostro sistema immunitario e dagli antibiotici stessi [3]. Insomma, un vero incubo per la salute pubblica.

Vaccini Tradizionali: Un Vicolo Cieco?

Di fronte a questa minaccia, la comunità scientifica non è stata con le mani in mano. Abbiamo provato a sviluppare vaccini, e alcuni studi hanno mostrato che potrebbero indurre una buona risposta immunitaria [13]. Purtroppo, però, i candidati vaccinali testati finora hanno fallito nelle fasi cliniche. Ad oggi, non esiste un vaccino autorizzato contro P. aeruginosa [Abstract Section]. Questi vaccini tradizionali hanno mostrato limiti, come instabilità o reazioni avverse [13]. Serviva un cambio di strategia radicale.

La Rivoluzione Digitale: Vaccinologia Inversa e Immunoinformatica

Ed è qui che entriamo in gioco noi, con un approccio che sembra uscito da un film di fantascienza: la vaccinologia inversa e l’immunoinformatica. Invece di coltivare il batterio in laboratorio e cercare “alla cieca” dei componenti utili per un vaccino, partiamo dal suo codice genetico e dalle sue proteine. Usiamo potenti computer e algoritmi sofisticati per analizzare l’intero “arsenale” del batterio e identificare i suoi punti deboli, le molecole chiave che possiamo usare come bersaglio per un vaccino super-specifico [Abstract Section, 13].

Questo approccio ha vantaggi enormi:

• È molto più veloce ed economico della ricerca tradizionale.
• Permette una precisione incredibile nel selezionare i bersagli giusti.
• Ci consente di progettare vaccini più sicuri e potenzialmente più stabili [13, 26, 27].

Certo, anche i vaccini peptidici multiepitopo (quelli che progettiamo noi, composti da piccoli pezzetti scelti delle proteine batteriche) hanno le loro sfide, come una potenziale bassa immunogenicità (cioè, potrebbero non stimolare abbastanza il sistema immunitario) [14, 28]. Ma abbiamo un asso nella manica anche per questo!

Colpire al Cuore: I Sistemi di Secrezione

Il nostro bersaglio principale sono i sistemi di secrezione di P. aeruginosa. Immaginateli come delle sofisticate “macchine molecolari” che il batterio usa per sparare fuori tossine, acquisire nutrienti, costruire il suo scudo di biofilm e persino pompare fuori gli antibiotici che cercano di ucciderlo [5]. P. aeruginosa ne ha ben sei tipi diversi (Tipo I, II, III, IV, V, VI), ognuno con le sue funzioni specifiche, ma tutti cruciali per la sua capacità di causare malattie e resistere ai farmaci [6-12].

La nostra idea è stata: se colpiamo le proteine fondamentali di questi sistemi, possiamo mandare in tilt l’intera macchina da guerra del batterio! Abbiamo identificato sei proteine chiave, una per ogni sistema di secrezione, che sembravano candidati ideali: TolC, GspD, PscC, VirB5, BamA e Hcp [15]. Queste proteine sono spesso esposte sulla superficie del batterio o sono comunque accessibili, rendendole ottimi bersagli per il sistema immunitario [16, 17].

Il Lavoro da Detective Digitale: Progettare il Vaccino Perfetto

Una volta identificate le proteine bersaglio, è iniziato il vero lavoro di “detective digitale”. Abbiamo usato una marea di strumenti bioinformatici per:

• Verificare che queste proteine fossero presenti nel ceppo di riferimento (PAO1) e capire dove si trovassero esattamente nella cellula batterica (membrana esterna? interna? citoplasma?) [Cello program].
• Assicurarci che non fossero simili a proteine umane, per evitare reazioni autoimmuni indesiderate (usando BLASTp contro il proteoma umano) [BLASTp analysis].
• Valutare la loro “antigenicità” e “immunogenicità”, cioè la loro capacità di essere riconosciute e di scatenare una risposta immunitaria (usando VaxiJen e altri tool) [VaxiJen analysis].
• Controllare se fossero fattori di virulenza noti o proteine essenziali per il batterio (usando database come VFDB e DEG) [VFDB, DEG analysis].
• Prevedere la loro struttura 3D e la loro solubilità [SWISS-MODEL, SolPro analysis].

Dopo questa rigorosa selezione, siamo rimasti con le nostre sei proteine candidate: TolC, GspD, PscC, VirB5, BamA e Hcp.

Costruire il Vaccino “Lego”: Gli Epitopi

A questo punto, non abbiamo usato le proteine intere. Abbiamo cercato i “pezzi” più importanti, quelli che vengono effettivamente riconosciuti dalle cellule del nostro sistema immunitario: gli epitopi. Abbiamo identificato gli epitopi per i linfociti T (sia CTL, i “killer”, che HTL, gli “aiutanti”) e per i linfociti B (quelli che producono gli anticorpi) [IEDB server analysis].

Abbiamo scelto gli epitopi migliori: quelli più immunogenici, non allergenici, non tossici, ben conservati tra diversi ceppi batterici e capaci di interagire con le molecole HLA (il nostro “sistema di riconoscimento” cellulare) più comuni nella popolazione mondiale [MHC-I, MHC-II prediction, VaxiJen, ToxinPred, MHCcluster analysis]. Un aspetto interessante è che abbiamo trovato epitopi “sovrapposti”, capaci cioè di stimolare sia i linfociti T killer che quelli helper, potenziando la risposta immunitaria [Overlap analysis].

Poi, abbiamo “assemblato” questi epitopi scelti come fossero mattoncini Lego, usando dei “connettori” speciali (linker peptidici come HEYGAEALERAG e GGGS) per creare una singola molecola: il nostro vaccino multiepitopo [Linker usage]. Abbiamo provato diverse combinazioni, creando ben nove potenziali strutture vaccinali.

Il Turbo: L’Adiuvante Flagellina

Ricordate la sfida della bassa immunogenicità? Per risolverla, abbiamo aggiunto un “turbo” al nostro vaccino: un adiuvante. Abbiamo scelto un pezzetto di una proteina chiamata flagellina (specificamente, la porzione N-terminale di *P. aeruginosa* PAO1, accessione AGY69124.1), nota per la sua capacità di legarsi a un recettore immunitario chiamato TLR5 e di stimolare potentemente sia la risposta cellulare che umorale [20, 21]. Abbiamo attaccato questo adiuvante all’inizio e alla fine della nostra catena di epitopi usando un altro linker specifico (EAAAK) [Adjuvant addition].

I Finalisti: Tre Candidati Promettenti

Dopo aver valutato tutte e nove le costruzioni per antigenicità, allergenicità (tutte non allergeniche!), solubilità e proprietà fisico-chimiche (usando VaxiJen, AlgPred, Protein-sol, Expasy ProtParam), abbiamo selezionato le tre migliori, che abbiamo chiamato V1, V2 e V3 [Vaccine selection, Table 6]. Queste tre “supermolecole” sembravano avere tutte le carte in regola: buona immunogenicità prevista, buona solubilità, stabilità e le giuste caratteristiche chimico-fisiche [Physicochemical analysis].

La Prova del Nove Virtuale: Il Docking Molecolare

Ma come si comporterebbero questi vaccini una volta incontrato il sistema immunitario? Per capirlo, abbiamo simulato al computer l’interazione tra i nostri tre candidati vaccinali e un importante recettore delle cellule immunitarie, il TLR4 (anche se l’adiuvante flagellina lega TLR5, il docking con TLR4 è spesso usato per valutare l’interazione generale con i recettori Toll-like). Abbiamo usato un software chiamato HADDOCK [HADDOCK analysis].

I risultati sono stati entusiasmanti! Tutti e tre i vaccini hanno mostrato una forte affinità di legame con TLR4, suggerendo che potrebbero effettivamente attivare le cellule immunitarie in modo efficace [Docking results, Table 7, Fig. 4, Fig. 6]. Abbiamo anche analizzato la stabilità strutturale dei vaccini e persino ottimizzato la sequenza genetica per una potenziale produzione futura nel batterio *E. coli* (un “cavallo di battaglia” per produrre proteine ricombinanti) e previsto la stabilità del loro mRNA [Disulfide engineering, Codon optimization, mRNA analysis, Fig. 7].

Cosa Significa Tutto Questo?

Abbiamo dimostrato, almeno sulla carta (o meglio, sullo schermo del computer!), che è possibile progettare un vaccino multiepitopo innovativo contro P. aeruginosa usando la vaccinologia inversa e l’immunoinformatica. Questo vaccino, colpendo i sistemi di secrezione essenziali del batterio e utilizzando un potente adiuvante, ha il potenziale per:

• Stimolare una forte risposta immunitaria (sia cellulare che anticorpale).
• Essere specifico, sicuro e stabile.
• Aggirare i meccanismi di resistenza del batterio.

Il nostro approccio, che combina bersagli multipli (epitopi da 6 proteine diverse) e meccanismi d’azione (colpire i sistemi di secrezione), potrebbe essere la chiave per superare i fallimenti passati [Discussion].

Il Prossimo Passo: Dal Digitale al Reale

Ovviamente, tutto questo lavoro è stato fatto “in silico”, cioè al computer. Il prossimo, cruciale passo è portare questi candidati vaccinali (V1, V2 e V3) in laboratorio. Serviranno test in vivo su modelli animali per verificare se le nostre previsioni sono corrette: il vaccino è davvero sicuro? Induce la risposta immunitaria che ci aspettiamo? Protegge dalle infezioni da P. aeruginosa? [Future work].

Siamo ottimisti. Crediamo che questo approccio basato sulla bioinformatica rappresenti una nuova frontiera nello sviluppo di vaccini, non solo contro P. aeruginosa, ma anche contro altri patogeni difficili. È un esempio affascinante di come la tecnologia digitale possa aiutarci a combattere alcune delle più grandi minacce per la nostra salute. Incrociamo le dita!

Fonte: Springer