Virus Contro Virus: La Mia Avventura nella Creazione di un’Arma contro l’Astrovirus dell’Oca!
Ciao a tutti! Oggi voglio raccontarvi di un progetto davvero affascinante a cui ho avuto la fortuna di lavorare, un’avventura nel mondo microscopico dei virus, con l’obiettivo di proteggere le nostre amiche oche da un nemico invisibile ma molto pericoloso. Parliamo del Goose Astrovirus (GAstV).
Un Nemico Insidioso: l’Astrovirus dell’Oca (GAstV)
Forse non ne avete mai sentito parlare, ma dal 2015, soprattutto lungo le coste della Cina, questo virus sta dando parecchio filo da torcere agli allevatori di oche. Si è diffuso rapidamente anche nell’entroterra, causando gravi perdite economiche. Ma cosa fa esattamente? Provoca una brutta malattia chiamata gotta viscerale nelle oche giovani (tra i 5 e i 15 giorni di vita), una condizione dolorosa che spesso porta alla morte. Immaginate un piccolo virus, rotondo, senza involucro, di appena 30 nanometri, che però è un concentrato di problemi.
Il GAstV è un virus a RNA a singolo filamento positivo, il cui genoma contiene le istruzioni per costruire se stesso. Tra queste istruzioni, c’è un gene chiamato ORF2. Questo gene è fondamentale perché contiene il progetto per la proteina del capside (Cap), l’involucro esterno del virus. La proteina Cap non solo è essenziale per assemblare nuove particelle virali, ma è anche la parte che il sistema immunitario dell’ospite riconosce. È, in pratica, il “volto” del virus, quello che scatena la produzione di anticorpi neutralizzanti.
Il problema? Ad oggi, non esiste un vaccino commerciale sicuro ed efficace contro il GAstV-1. E qui entriamo in gioco noi scienziati!
La Nostra Strategia: Un “Cavallo di Troia” Virale
Come combattere un virus senza un vaccino specifico? Abbiamo pensato: e se usassimo un altro virus, già conosciuto e “addomesticato”, come veicolo per trasportare un pezzo chiave del GAstV e insegnare al sistema immunitario dell’oca a riconoscerlo?
La nostra scelta è caduta sul Virus dell’Enterite dell’Anatra (DEV), noto anche come Anatid herpesvirus 1. Questo virus causa anch’esso una malattia negli anatidi, ma ne esiste un ceppo vaccinale vivo attenuato, sicuro ed efficace. Il DEV ha caratteristiche fantastiche per fare da “vettore”:
- Ha un genoma grande, come molti herpesvirus, con geni non essenziali che possiamo sostituire senza danneggiarlo.
- È geneticamente stabile.
- Non viene troppo disturbato dagli anticorpi materni.
- Può persistere a lungo nell’ospite, stimolando l’immunità.
Insomma, il DEV ci è sembrato il candidato ideale per diventare il nostro “cavallo di Troia”. L’idea era inserire il gene ORF2 del GAstV nel genoma del DEV. In questo modo, il DEV modificato, una volta somministrato, avrebbe prodotto non solo le sue proteine, ma anche la proteina Cap del GAstV, esponendola al sistema immunitario. Un potenziale vaccino bivalente: protezione contro DEV e GAstV con una sola mossa!
Costruire il Nostro Virus Ricombinante: Un Lavoro di Precisione
Come abbiamo fatto? Abbiamo utilizzato una tecnica di ingegneria genetica molto precisa chiamata ricombinazione Red E/T a due passaggi. In parole semplici, è come un “taglia e cuci” genetico.
- Siamo partiti da un clone BAC (Cromosoma Artificiale Batterico) infettivo del ceppo vaccinale di DEV, che avevamo già preparato nel nostro laboratorio. Questo BAC contiene l’intero genoma del DEV e può essere manipolato facilmente nei batteri.
- Abbiamo preso il gene ORF2 del GAstV (la sequenza di riferimento era quella del ceppo GenBank MH052598, ottimizzata per essere “letta” meglio dalle cellule di anatra) e lo abbiamo inserito in una regione specifica del genoma del DEV, tra i geni US7 e US8, una zona considerata non essenziale. Abbiamo aggiunto anche dei segnali (promotore PCMV, segnale di poliadenilazione BGH) per assicurarci che il gene venisse espresso correttamente.
- Abbiamo usato i batteri per fare il lavoro sporco di ricombinazione, selezionando quelli che avevano incorporato correttamente il nostro inserto (prima con un gene marcatore di resistenza a un antibiotico, la Kanamicina, e poi rimuovendolo).
- Una volta ottenuto il DNA del DEV modificato (chiamato pDEV-GAstV ORF2), lo abbiamo isolato e usato per “infettare” (trasfettare) delle cellule speciali: i Fibroblasti Embrionali di Pollo (CEF). Queste cellule sono come delle piccole fabbriche che possono produrre virus.
- Dopo qualche giorno, abbiamo visto i segni tipici dell’infezione da DEV (effetto citopatico) e la fluorescenza (avevamo mantenuto un gene reporter nel vettore), segno che il nostro virus ricombinante, che abbiamo battezzato rDEV-GAstV ORF2, era vivo e vegeto!
La Prova del Nove: Funziona Davvero?
Creare il virus era solo il primo passo. Dovevamo essere sicuri che facesse quello che volevamo: produrre la proteina Cap del GAstV. E qui sono iniziati i test di verifica.
Western Blotting: Abbiamo infettato le cellule CEF con il nostro rDEV-GAstV ORF2 e con il virus DEV originale (rDEV-EF1) come controllo. Poi abbiamo estratto le proteine dalle cellule e dal terreno di coltura e le abbiamo separate in base alla dimensione. Usando un anticorpo specifico che riconosce solo la proteina Cap del GAstV, abbiamo cercato la sua presenza. Bingo! Abbiamo trovato una banda della dimensione attesa (circa 82 kDa) solo nei campioni infettati con il nostro virus ricombinante, sia nelle cellule che nel surnatante. Era la prova che la proteina Cap veniva prodotta!
Immunofluorescenza Indiretta (IFA): Volevamo anche “vedere” la proteina dentro le cellule. Abbiamo infettato le cellule su vetrini, le abbiamo fissate e poi abbiamo usato lo stesso anticorpo anti-Cap, questa volta legato a una molecola fluorescente (Cy3, che emette luce rossa). Osservando al microscopio a fluorescenza e confocale, abbiamo visto chiaramente la fluorescenza rossa all’interno delle cellule infettate con rDEV-GAstV ORF2, localizzata principalmente nel citoplasma. Il virus originale non mostrava nulla. Un’altra conferma!
Microscopia Elettronica a Immunogold (IEM): Questa è stata la parte più emozionante. La proteina Cap del GAstV ha la capacità di auto-assemblarsi formando delle strutture vuote che assomigliano al virus originale, chiamate Particelle Simili a Virus (VLP). Queste VLP sono fantastiche per i vaccini perché stimolano molto bene il sistema immunitario pur essendo totalmente innocue (non contengono materiale genetico). Abbiamo preparato sezioni ultrasottili delle cellule infettate e le abbiamo trattate con l’anticorpo anti-Cap legato a particelle d’oro colloidale (visibili come puntini neri al microscopio elettronico). Ebbene, abbiamo osservato chiaramente la formazione di VLP nel citoplasma delle cellule, decorate dai puntini d’oro che marcavano la proteina Cap! Erano lì, auto-assemblate, proprio come speravamo!
Comportamento del Virus Ricombinante
Abbiamo anche confrontato il nostro rDEV-GAstV ORF2 con il virus DEV originale (rDEV-EF1). Abbiamo notato che le “placche” di infezione formate dal virus ricombinante erano leggermente più piccole (circa il 16% in meno), suggerendo una replicazione un po’ più lenta. Tuttavia, analizzando le curve di crescita nel tempo (misurando la quantità di virus prodotta a diverse ore dall’infezione), abbiamo visto che le caratteristiche generali di crescita erano molto simili a quelle del virus parentale. Questo è un buon segno: l’inserimento del gene estraneo non ha compromesso drasticamente la capacità del DEV di replicarsi.
Verso un Vaccino Bivalente: Prospettive Future
Cosa significa tutto questo? Abbiamo dimostrato con successo che è possibile usare il virus DEV come vettore per esprimere in vitro (cioè in colture cellulari) la proteina Cap dell’astrovirus dell’oca. Non solo la proteina viene prodotta, ma è anche capace di formare VLP, il che è estremamente promettente dal punto di vista immunologico.
Questo lavoro getta le basi per lo sviluppo di un potenziale vaccino bivalente che potrebbe proteggere gli allevamenti sia dall’enterite dell’anatra che dalla devastante gotta viscerale causata dal GAstV. Certo, la strada è ancora lunga. Il prossimo passo fondamentale sarà testare questo candidato vaccino in vivo, cioè negli animali (oche), per verificare se è davvero sicuro e se induce una protezione efficace contro entrambi i virus.
È stato un viaggio incredibile nel piccolo mondo dei virus, un esempio di come la biotecnologia e la virologia possano collaborare per trovare soluzioni innovative a problemi concreti che affliggono l’allevamento e la salute animale. Incrociamo le dita per i prossimi sviluppi!
Fonte: Springer
