Congelare la Speranza: Un Nuovo Trucco Enzimatico Potrebbe Rivoluzionare la Crioconservazione Ovarica

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di qualcosa che mi sta molto a cuore e che rappresenta una frontiera affascinante della ricerca medica: la preservazione della fertilità, specialmente nelle ragazze più giovani che affrontano terapie oncologiche. Sapete, quando una donna adulta deve sottoporsi a cure potenzialmente dannose per la sua fertilità, spesso si possono congelare ovociti o embrioni. Ma per le bambine e le adolescenti prima della pubertà, questa strada non è percorribile. L’unica opzione concreta è la crioconservazione del tessuto ovarico (OTC), che consiste nel prelevare e congelare una piccola parte dell’ovaio per poi trapiantarla in futuro.

Sembra fantascienza, vero? Eppure, grazie a questa tecnica, sono già nati più di 200 bambini nel mondo! È una speranza incredibile. Però, c’è un “ma”. Il processo di congelamento e scongelamento è molto stressante per il tessuto e si stima che circa il 50% dei preziosi follicoli (le strutture che contengono gli ovociti) vada perso a causa dei danni. Un bel problema, non trovate?

La Sfida: Il Tessuto Ovarico è “Tosto” da Congelare

Uno dei motivi di questa perdita è la rigidità del tessuto ovarico stesso, chiamato stroma. Immaginate di dover far penetrare uniformemente delle sostanze protettive (i crioprotettori) in un materiale denso e compatto prima di congelarlo rapidamente. Non è facile! Questa rigidità ostacola la sopravvivenza dei follicoli durante il congelamento e lo scongelamento.

Da tempo ci si chiede: e se potessimo rendere il tessuto un po’ meno “rigido” prima di congelarlo? L’idea è che un tessuto più “morbido” potrebbe permettere una migliore penetrazione dei crioprotettori e sopportare meglio lo stress termico. Finora, però, c’erano pochissime informazioni su come modulare questa rigidità in modo sicuro ed efficace. Solo uno studio precedente, su topoline, aveva provato a usare un enzima (la collagenasi) con risultati incoraggianti, ma il modello animale era molto diverso da quello umano.

La Nostra Idea: Usare gli Enzimi per “Ammorbidire” il Tessuto

Ecco dove entra in gioco la nostra ricerca. Ci siamo chiesti: potremmo usare degli enzimi, sostanze che normalmente aiutano a “digerire” o disgregare i tessuti, per trattare brevemente il tessuto ovarico prima di congelarlo? L’obiettivo era trovare un enzima che riducesse la rigidità quel tanto che basta per migliorare la sopravvivenza delle cellule dopo lo scongelamento, senza però danneggiare la struttura fondamentale.

Per i nostri esperimenti, abbiamo usato ovaie di pecora. Perché proprio la pecora? Perché le sue ovaie sono sorprendentemente simili a quelle umane per struttura, tipo di follicoli e densità del tessuto corticale. È un ottimo modello per questo tipo di studi.

Abbiamo selezionato cinque enzimi comunemente usati nei laboratori per isolare cellule dai tessuti:

• TrypLE
• Collagenasi
• Dispase
• Accutase
• Ialuronidasi

Abbiamo preso piccoli frammenti di tessuto ovarico di pecora e li abbiamo trattati per soli 10 minuti con ciascuno di questi enzimi (più un gruppo di controllo senza enzimi). Dopodiché, li abbiamo congelati seguendo un protocollo specifico di congelamento lento e conservati in azoto liquido a -196°C.

Dopo lo scongelamento, abbiamo valutato diversi parametri cruciali:

• Vitalità cellulare: Quante cellule erano ancora vive? Abbiamo usato una tecnica di colorazione fluorescente (verde per le vive, rosso per le morte) e, per la prima volta in questo contesto, una tecnica chiamata “clearing” per rendere il tessuto trasparente e vedere meglio all’interno.
• Integrità tissutale: La struttura generale del tessuto e dei follicoli era intatta o danneggiata? Lo abbiamo verificato osservando sezioni sottili al microscopio.
• Proliferazione cellulare: Le cellule erano ancora in grado di dividersi? Abbiamo cercato una proteina chiamata Ki67, un marcatore di proliferazione.
• Apoptosi (morte cellulare programmata): C’erano segni di morte cellulare indotta dallo stress? Abbiamo cercato un’altra proteina, la Caspase-3.

Abbiamo fatto queste valutazioni subito dopo lo scongelamento (tempo 0) e dopo aver tenuto i tessuti in coltura per 2 e 7 giorni, per vedere come se la cavavano nel tempo.

I Risultati: TrypLE si Dimostra il Campione!

E qui arriva la parte entusiasmante! I risultati sono stati piuttosto chiari. Subito dopo lo scongelamento, il trattamento che ha dato i risultati migliori è stato quello con TrypLE. I campioni trattati con TrypLE mostravano:

• La più alta percentuale di cellule vive.
• La più alta percentuale di follicoli morfologicamente intatti.
• Nessun segno di apoptosi (Caspase-3 negativa) nei follicoli.

Al contrario, il trattamento con Accutase è stato un vero disastro: ha danneggiato gravemente il tessuto e ha mostrato i valori di vitalità più bassi in assoluto. Gli altri enzimi (collagenasi, dispase, ialuronidasi) hanno dato risultati intermedi o simili al controllo non trattato, a volte con danni evidenti ai bordi del tessuto.

Anche dopo 2 giorni di coltura, TrypLE continuava a mostrare una migliore integrità tissutale e, insieme alla ialuronidasi, era l’unico trattamento in cui si trovavano ancora follicoli antrali con cellule in proliferazione (Ki67 positive). Dopo 7 giorni, sebbene la vitalità generale diminuisse in tutti i gruppi (come purtroppo ci si aspetta dopo crioconservazione), il gruppo TrypLE manteneva ancora la vitalità più alta e, cosa notevole, era l’unico in cui i follicoli primordiali (la riserva più preziosa) non mostravano segni di apoptosi.

Perché TrypLE Funziona Meglio? E Cosa Significa?

Questa è la prima volta che vengono confrontati diversi enzimi in questo modo per la crioconservazione ovarica. I nostri risultati suggeriscono che un breve pre-trattamento con TrypLE potrebbe davvero fare la differenza. L’ipotesi è che questo enzima riesca a “rilassare” la matrice extracellulare quel tanto che basta per permettere ai crioprotettori di penetrare meglio e più uniformemente, proteggendo così le cellule durante il congelamento senza causare danni strutturali significativi. Al contrario, altri enzimi come l’Accutase sembrano essere troppo aggressivi per questo delicato tessuto.

È interessante notare che la collagenasi, che aveva dato buoni risultati nello studio sui topi, nel nostro caso non ha mostrato particolari benefici rispetto al controllo, evidenziando come sia fondamentale testare queste strategie su modelli animali più vicini all’uomo.

Inoltre, l’uso della tecnica di “clearing” per valutare la vitalità si è rivelato molto utile, permettendoci di ottenere una visione più chiara e quantificabile dello stato di salute dell’intero frammento di tessuto, e non solo dei singoli follicoli contati uno a uno.

Prossimi Passi: Verso l’Applicazione Clinica

Ovviamente, siamo solo all’inizio. Questi risultati sono promettenti, ma ottenuti su un modello animale. Il prossimo passo fondamentale sarà verificare se il trattamento con TrypLE offre gli stessi benefici sul tessuto ovarico umano, sia adulto che, soprattutto, pre-pubere (quello delle bambine per cui questa tecnica è cruciale). Bisognerà anche ottimizzare ulteriormente il protocollo (magari la concentrazione di TrypLE o il tempo di incubazione) e, importantissimo, studiare gli effetti a lungo termine dopo il trapianto del tessuto trattato, per essere sicuri che non ci siano effetti collaterali indesiderati e che la funzionalità ovarica venga effettivamente ripristinata.

Insomma, la strada è ancora lunga, ma crediamo che questa scoperta possa rappresentare un tassello importante per migliorare le tecniche di crioconservazione ovarica e offrire una speranza ancora più concreta di futura maternità alle giovani pazienti oncologiche. È un lavoro che ci appassiona e che speriamo possa fare la differenza nella vita di molte persone.

Fonte: Springer