Glioblastoma: Come Stiamo Cercando di Vincere la Resistenza alla Chemioterapia

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di una sfida enorme nel campo dell’oncologia: il glioblastoma (GBM), in particolare la forma IDH-wildtype di grado IV. Si tratta di uno dei tumori cerebrali più aggressivi e difficili da trattare. Le opzioni terapeutiche sono purtroppo limitate e, anche quando funzionano inizialmente, spesso il tumore sviluppa una resistenza che rende le cure inefficaci.

Il Nemico Numero Uno: La Resistenza al TMZ

Il trattamento standard per il glioblastoma prevede la rimozione chirurgica del tumore (quando possibile), seguita da radioterapia e chemioterapia con un farmaco chiamato temozolomide (TMZ). Il TMZ è un agente alchilante, il che significa che danneggia il DNA delle cellule tumorali per impedirne la crescita. Purtroppo, anche questa combinazione terapeutica porta a una sopravvivenza a 5 anni in meno del 5% dei pazienti. Il motivo principale? La resistenza acquisita. Il tumore, inizialmente sensibile, impara a difendersi dal TMZ, rendendo la terapia inefficace e portando a recidive.

Capire come il tumore sviluppa questa resistenza è fondamentale per trovare nuove strategie. Attualmente conosciamo alcuni meccanismi principali:

• Riattivazione di enzimi di riparazione diretta: Enzimi come MGMT e ALKBH possono “annullare” il danno indotto dal TMZ. Se il tumore ne produce di più, resiste meglio. La presenza o assenza di MGMT (spesso silenziato epigeneticamente) è un fattore prognostico importante.
• Perdita della riparazione del mismatch (MMR): Il sistema MMR normalmente aiuta a riconoscere e riparare certi tipi di danno al DNA, ma nel contesto del danno da TMZ, può innescare segnali di morte cellulare. Se questo sistema si perde, la cellula tumorale sopravvive più facilmente.
• Potenziamento della riparazione delle rotture del doppio filamento del DNA (DSB): Il danno finale e letale causato dal TMZ spesso coinvolge le rotture del doppio filamento del DNA. Se le cellule tumorali diventano super efficienti nel riparare queste rotture, possono sopravvivere all’attacco del farmaco. Questa via sembra essere particolarmente importante nei tumori con MGMT compromesso.

Proprio su quest’ultimo punto si concentra la nostra attenzione. Molte proteine coinvolte nella riparazione dei DSB sono state esplorate come potenziali bersagli terapeutici, ma c’è sempre bisogno di nuove opzioni, anche perché molti farmaci faticano a superare la barriera emato-encefalica (BBB) e raggiungere efficacemente il tumore nel cervello.

Una Nuova Speranza: La Chinasi TLK1

Ed ecco che entra in gioco una proteina specifica: la Tousled-like kinase 1 (TLK1). Si tratta di una chinasi (un tipo di enzima che aggiunge gruppi fosfato ad altre proteine, modificandone l’attività) il cui ruolo è stato implicato proprio nella riparazione dei DSB e nella resistenza alla radioterapia. Studi precedenti hanno mostrato che TLK1 è spesso sovraespresso in molti tumori umani, incluso il glioblastoma. Anzi, eliminare o inibire TLK1 sembra promuovere la morte delle cellule tumorali inducendo proprio l’accumulo di DSB.

Abbiamo quindi ipotizzato: e se TLK1 fosse uno dei protagonisti della resistenza al TMZ nel glioblastoma? Se aiutasse le cellule tumorali a riparare i danni indotti dal farmaco, bloccandolo potremmo forse renderle di nuovo vulnerabili? Questa è stata la scintilla che ha acceso la nostra ricerca.

Sviluppare un’Arma Specifica: L’Inibitore J54

Per testare la nostra ipotesi, avevamo bisogno di un modo per bloccare TLK1. Fortunatamente, nel nostro laboratorio avevamo già sviluppato e caratterizzato un inibitore specifico di TLK1, chiamato J54. Questa molecola appartiene alla classe delle fenotiazine, farmaci noti per la loro capacità di attraversare la barriera emato-encefalica – un vantaggio non da poco quando si tratta di tumori cerebrali! Studi precedenti avevano già indicato J54 come un candidato promettente contro il GBM. L’obiettivo era quindi valutare il potenziale terapeutico di J54 proprio nel contesto della resistenza acquisita al TMZ.

Mettere alla Prova J54: Gli Esperimenti

Il primo passo è stato creare un modello di resistenza in laboratorio. Abbiamo preso una linea cellulare di glioblastoma nota per essere sensibile al TMZ (LN229, che ha il gene MGMT silenziato) e l’abbiamo esposta in modo intermittente a dosi crescenti di TMZ per oltre sei mesi. Un processo lungo e paziente, che ha selezionato le cellule capaci di sopravvivere e proliferare nonostante il farmaco. Queste cellule, che abbiamo chiamato LN229 TMZ-R (resistenti), hanno mostrato una sopravvivenza significativamente maggiore al TMZ rispetto alle cellule originali (TMZ-S, sensibili), confermando l’acquisizione della resistenza.

Curiosamente, abbiamo notato che le cellule TMZ-R cambiavano anche aspetto: diventavano più allungate, appiattite, quasi “stirate”. Analizzando i marcatori molecolari, abbiamo visto un aumento delle proteine tipiche delle cellule epiteliali (come la E-caderina) e una diminuzione di quelle mesenchimali (N-caderina, Vimentina). Questo fenomeno, chiamato Transizione Mesenchimale-Epiteliale (MET), è l’opposto della più nota transizione epitelio-mesenchimale (EMT) associata alla metastasi, ma recenti evidenze suggeriscono che anche la MET possa giocare un ruolo nella resistenza ai farmaci, forse stabilizzando le cellule resistenti e permettendo loro di crescere in modo clonale.

A questo punto, abbiamo verificato i livelli di TLK1: come sospettavamo, le cellule TMZ-R esprimevano livelli più alti di TLK1 e mostravano una maggiore attività della sua via di segnalazione (misurata tramite la fosforilazione di un suo bersaglio, Nek1). Era il momento di testare J54.

I risultati sono stati davvero incoraggianti:

• Citotossicità: J54 ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule TMZ-R in modo dose-dipendente, mentre queste cellule rimanevano indifferenti anche a dosi elevate di TMZ.
• Crescita Clonale: J54 ha drasticamente ridotto la capacità delle cellule TMZ-R di formare colonie.
• Inibizione del Segnale: J54 ha diminuito la fosforilazione dei bersagli noti di TLK1 (Rad9 e Nek1), confermando che stava effettivamente bloccando l’attività della chinasi all’interno delle cellule.
• Accumulo di Danno al DNA: Coerentemente con il blocco della riparazione, le cellule trattate con J54 mostravano un aumento significativo di γH2AX, un marcatore delle rotture del doppio filamento del DNA.
• Induzione di Morte Cellulare: L’accumulo di danno portava alla morte cellulare, come confermato da esperimenti di colorazione specifici (Propidio Ioduro).

Non Solo Uccidere, Ma Anche Fermare la Diffusione

Ma non è tutto. Sappiamo che TLK1 è coinvolto anche nella motilità e nell’invasività delle cellule tumorali, processi fondamentali per la progressione del cancro e la formazione di metastasi. TLK1 regola il citoscheletro di actina, essenziale per il movimento cellulare. Abbiamo quindi verificato se J54 potesse influenzare anche questi aspetti nelle cellule TMZ-R.

Abbiamo condotto due tipi di test:

• Wound Healing Assay: Creiamo un “graffio” in uno strato di cellule e misuriamo quanto tempo impiegano a richiuderlo migrando. Le cellule trattate con J54 erano significativamente più lente nel chiudere il “graffio”.
• Transwell Invasion Assay: Mettiamo le cellule in una camera superiore separata da una membrana rivestita di matrice extracellulare (che mima il tessuto circostante) e vediamo quante riescono a invadere la camera inferiore. J54 ha ridotto notevolmente il numero di cellule capaci di invadere.

Questi risultati suggeriscono che J54 non solo uccide le cellule resistenti, ma potrebbe anche limitarne la capacità di diffondersi nel cervello.

Cosa Significa Tutto Questo?

Il nostro studio getta nuova luce sul ruolo di TLK1 come attore chiave nella resistenza acquisita al temozolomide nel glioblastoma. Abbiamo dimostrato che le cellule di GBM che diventano resistenti al TMZ sovraesprimono TLK1 e che l’inibizione di questa chinasi con la nostra molecola J54 è efficace nel:

• Uccidere queste cellule resistenti inducendo danno al DNA e morte cellulare.
• Ridurre la loro capacità di migrare e invadere.

Questo identifica TLK1 come un bersaglio terapeutico di grande valore e J54 come un potenziale farmaco per affrontare la sfida della resistenza nel glioblastoma. La capacità di J54 di attraversare potenzialmente la barriera emato-encefalica lo rende particolarmente interessante per questa patologia.

Ovviamente, siamo ancora a livello di studi preclinici in laboratorio. La strada per arrivare a una terapia per i pazienti è ancora lunga e richiederà ulteriori ricerche e validazioni. Tuttavia, identificare meccanismi di resistenza specifici e sviluppare inibitori mirati come J54 rappresenta un passo avanti fondamentale e ci dà una speranza concreta per migliorare il trattamento di questo tumore cerebrale così devastante. La battaglia contro il glioblastoma è dura, ma la ricerca non si arrende!

Fonte: Springer