Eumicetoma: Un Nuovo Test Rivoluziona la Diagnosi nelle Zone Endemiche!

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di una sfida diagnostica che affligge molte aree remote del mondo e di come la scienza stia cercando di fare la differenza con strumenti innovativi. Parliamo di micetoma, una di quelle malattie tropicali trascurate (NTD) che non fa molto rumore sui media, ma che può avere conseguenze devastanti per chi ne soffre.

Cos’è il Micetoma e Perché è un Problema Serio?

Immaginate un’infezione cronica che si insinua sotto la pelle, nei tessuti sottocutanei. Non è un semplice brufolo, ma qualcosa che cresce lentamente, formando masse simili a tumori. Da queste masse, attraverso delle aperture chiamate seni, fuoriesce un pus denso che contiene delle strutture particolari, i cosiddetti “grani”, che sono aggregati del patogeno responsabile. Sembra uscito da un film dell’orrore, vero? Purtroppo, è la realtà per molte persone, soprattutto nelle aree rurali delle regioni tropicali e subtropicali.

Questa condizione può essere causata sia da batteri (e allora si parla di actinomicetoma) sia da funghi (eumicetoma). Se non viene trattato per tempo, il micetoma può portare a deformità gravi, disabilità permanenti e, nei casi più sfortunati, persino alla morte. Capite bene quanto sia cruciale una diagnosi rapida e precisa.

I principali indiziati per l’eumicetoma, la forma fungina, sono due funghi in particolare: Madurella mycetomatis (responsabile di circa l’85% dei casi) e Falciformispora senegalensis (circa il 4%). Identificare l’agente specifico è fondamentale perché il trattamento cambia a seconda del colpevole!

I Limiti della Diagnosi Tradizionale

Qui arriva il nodo cruciale. Come si fa a diagnosticare l’eumicetoma oggi, specialmente in quelle zone remote dove la malattia è più diffusa? I metodi classici, come l’analisi istologica (guardare un pezzetto di tessuto al microscopio) o la coltura (far crescere il fungo in laboratorio), hanno i loro bei problemi. Sono lenti – parliamo di giorni, a volte settimane, per avere un risultato – e non sempre accurati. La sensibilità e la specificità non sono ottimali, il che significa che a volte non rilevano la malattia quando c’è (falsi negativi) o la confondono con altro (falsi positivi).

Certo, esistono tecniche molecolari molto più affidabili, come la PCR (Reazione a Catena della Polimerasi). La PCR, soprattutto nelle sue varianti più moderne come la qPCR (PCR quantitativa), è fantastica: è sensibile, specifica e relativamente veloce (parliamo di ore, non giorni). Permette di identificare con precisione specie come M. mycetomatis e altre correlate. Ma c’è un “ma” grande come una casa: queste tecniche richiedono attrezzature costose e ingombranti (i termociclatori), laboratori ben attrezzati e personale altamente specializzato. Tutte cose che, purtroppo, scarseggiano proprio là dove ce ne sarebbe più bisogno, nei centri sanitari primari delle aree endemiche.

L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha sottolineato nel 2022 che per gestire al meglio l’eumicetoma serve una diagnosi rapida, possibilmente “point-of-care”, cioè eseguibile vicino al paziente, senza dover spedire campioni a laboratori lontani.

La Svolta: L’Amplificazione Isoterma RPA

Ed è qui che entriamo in gioco noi, o meglio, la nostra ricerca per trovare una soluzione più adatta al “campo”. Abbiamo pensato: e se potessimo usare una tecnologia molecolare potente come la PCR, ma senza i suoi svantaggi? Una tecnologia che funzioni a temperatura costante (isoterma), eliminando la necessità dei complessi termociclatori?

Questa tecnologia esiste e si chiama Recombinase Polymerase Amplification (RPA). L’RPA è una specie di “PCR semplificata” che amplifica il DNA molto rapidamente (spesso in meno di 30 minuti) a una temperatura costante (di solito intorno ai 37-42°C, facile da mantenere anche con dispositivi semplici). È anche nota per essere più tollerante a eventuali sostanze “inquinanti” presenti nel campione che potrebbero bloccare la PCR tradizionale. Insomma, sembra fatta apposta per le condizioni operative che si trovano nelle aree remote!

Già in passato l’RPA si era dimostrata promettente. Ad esempio, è stata usata per sviluppare un laboratorio mobile “in valigia” per diagnosticare la Leishmaniosi, con risultati paragonabili alla PCR ma ottenuti molto più velocemente. Nel 2015, era stato sviluppato un test RPA specifico per M. mycetomatis, ma richiedeva ancora passaggi aggiuntivi (purificazione e visualizzazione su gel) che ne limitavano l’uso sul campo.

La nostra idea è stata quella di fare un passo avanti: sviluppare un test RPA multiplex (cioè capace di rilevare più bersagli contemporaneamente) e basato su sonde fluorescenti. Questo significa che non serve il gel: il risultato si legge direttamente come un segnale luminoso, misurabile con strumenti portatili.

Come Funziona il Nostro Test Multiplex?

Il nostro obiettivo era ambizioso: creare un unico test RPA in grado di fare tre cose:

• Rilevare la presenza di DNA fungino in generale (un test “pan-fungino”).
• Identificare specificamente il DNA di Madurella mycetomatis.
• Identificare specificamente il DNA di Falciformispora senegalensis.

Per fare questo, abbiamo progettato dei primer (le “micce” che danno inizio all’amplificazione) e delle sonde specifiche. I primer sono stati disegnati per amplificare una regione del DNA fungino chiamata Internal Transcribed Spacer (ITS), una sorta di codice a barre genetico comune a molti funghi. Poi, abbiamo creato tre sonde diverse, ognuna legata a un colorante fluorescente differente:

1. Una sonda pan-fungina (marcata con Cy5) che si illumina se c’è DNA fungino di qualsiasi tipo tra quelli che causano eumicetoma.
2. Una sonda specifica per M. mycetomatis (marcata con FAM) che si illumina solo se è presente il DNA di questo fungo.
3. Una sonda specifica per F. senegalensis (marcata con HEX) che si illumina solo in presenza del DNA di quest’altro fungo.

In pratica, mettiamo il DNA estratto dal campione (ad esempio, dai “grani” prelevati dalla lesione) insieme ai reagenti RPA e alle sonde in una provetta, la scaldiamo a 37°C e monitoriamo la fluorescenza. Se si accende la luce Cy5, sappiamo che c’è un fungo. Se si accende anche la luce FAM, è M. mycetomatis. Se invece si accende la HEX, è F. senegalensis. Semplice, no?

I Risultati: Veloce, Preciso e Specifico

Ovviamente, prima di cantare vittoria, abbiamo dovuto testare a fondo il nostro sistema. Abbiamo usato il DNA estratto da una vasta collezione di isolati: 71 ceppi fungini diversi (includendo 44 M. mycetomatis, 6 F. senegalensis e altre specie correlate o che potrebbero causare confusione) e 5 ceppi batterici che causano actinomicetoma (come controllo negativo, per assicurarci che il test non desse falsi positivi).

I risultati sono stati davvero incoraggianti!

• Specificità perfetta: La sonda per M. mycetomatis si è accesa solo e soltanto per i 44 campioni di M. mycetomatis. La sonda per F. senegalensis si è accesa solo per i 6 campioni di F. senegalensis. Nessuna delle due ha reagito con altri funghi (nemmeno specie molto simili come F. tompkinsii) o con i batteri. La sonda pan-fungina (ITS) si è accesa correttamente per tutti i 71 campioni fungini, ma non per i batteri. Zero cross-reattività!
• Velocità impressionante: Il tempo medio per ottenere un segnale positivo è stato di soli 9.3 minuti per M. mycetomatis, 7.6 minuti per F. senegalensis e 13.1 minuti per la sonda pan-fungina ITS. In pratica, in meno di 20 minuti si può avere una diagnosi completa! Confrontatelo con le ore della PCR o i giorni/settimane dei metodi tradizionali!
• Sensibilità elevata: Abbiamo anche determinato il limite di rilevamento (LOD), cioè la quantità minima di DNA che il test riesce a “vedere”. Nel nostro test multiplex, siamo riusciti a rilevare in modo affidabile fino a 0.01 nanogrammi (ng) di DNA fungino per F. senegalensis e 0.1 ng per M. mycetomatis e la sonda ITS. Anche se in modalità multiplex la sensibilità è leggermente inferiore rispetto a testare ogni sonda singolarmente (dove arrivavamo a 0.001 ng per F. senegalensis e 0.01 ng per gli altri), è comunque una sensibilità altissima. Pensate che da un singolo “grano” di micetoma si estraggono in media almeno 30 ng di DNA, quindi siamo ampiamente dentro i limiti per una diagnosi affidabile da campioni clinici.

Costi e Applicazioni sul Campo: Una Speranza Concreta

Un aspetto fondamentale per l’adozione di un nuovo test in aree a basse risorse è il costo. Abbiamo fatto due conti. Il costo dei soli reagenti per analizzare un campione con il nostro test multiplex è di circa €1.35. Ovviamente, bisogna considerare anche il costo della strumentazione per leggere la fluorescenza e dei materiali di consumo (provette, pipette, ecc.).

Se usassimo una macchina da laboratorio standard come quella che abbiamo usato per la validazione (una Roche LightCycler 480) e le sue piastre da 96 pozzetti, il costo per singolo campione schizzerebbe a circa €10.03 se analizzassimo un solo campione alla volta (perché la piastra costa molto). Ma questo non è lo scenario realistico per l’uso sul campo.

Immaginando invece di usare strumenti più semplici e portatili, magari con provette singole o strisce di provette (come le EasyStrip™), il costo totale per campione potrebbe scendere a circa €1.56. Questo è un costo decisamente più accessibile e in linea con i criteri di sostenibilità per i test diagnostici in contesti difficili. Certo, non abbiamo incluso i costi di manodopera o l’acquisto iniziale dello strumento, ma il costo per reazione è molto promettente.

Guardando al Futuro

In conclusione, siamo riusciti a sviluppare un test RPA multiplex che rileva il DNA fungino e discrimina tra i due principali agenti dell’eumicetoma, M. mycetomatis e F. senegalensis, in meno di 20 minuti, con alta specificità e sensibilità, e con un potenziale costo contenuto. È importante sottolineare che questo è, a nostra conoscenza, il primo test molecolare diretto specificamente progettato per F. senegalensis.

Certo, il prossimo passo fondamentale sarà la validazione clinica, cioè testare il sistema su campioni reali prelevati da pazienti, per confermare le sue prestazioni “sul campo”. Ma i risultati ottenuti finora sono estremamente promettenti.

Questo strumento ha il potenziale per cambiare davvero le carte in tavola nella diagnosi dell’eumicetoma nelle regioni endemiche. Una diagnosi più rapida e accurata significa poter iniziare prima il trattamento giusto, migliorando significativamente la gestione dei pazienti, riducendo le complicanze e, speriamo, migliorando la loro qualità di vita. È un piccolo passo nella ricerca, ma potrebbe essere un grande passo per combattere una malattia dimenticata.

Fonte: Springer