Tumori con Difetti nel DNA? Ora li “Vediamo” in un Giorno con HR eye e MMR eye!

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di una cosa che, da ricercatore, mi entusiasma parecchio e che potrebbe davvero fare la differenza nella lotta contro certi tipi di cancro. Immaginate il nostro DNA come un manuale di istruzioni incredibilmente complesso e prezioso per le nostre cellule. A volte, però, in questo manuale si creano degli “errori di battitura” o delle pagine si strappano. Fortunatamente, le nostre cellule hanno dei meccanismi di “correzione bozze” e “riparazione” super efficienti. Due dei più importanti si chiamano Ricombinazione Omologa (HR) e Riparazione degli Appaiamenti Errati (MMR).

Pensate a loro come ai guardiani del nostro genoma. Quando questi guardiani non funzionano a dovere, le cellule possono accumulare errori nel DNA e, ahimè, trasformarsi in cellule tumorali. Si stima che almeno un quarto di tutti i tumori maligni abbia problemi proprio in questi sistemi di riparazione. La buona notizia? Spesso, i tumori con questi specifici difetti rispondono particolarmente bene a terapie mirate, come gli inibitori di PARP (per i difetti HR) o l’immunoterapia (per i difetti MMR). Un po’ come trovare la chiave giusta per una serratura molto specifica.

Ma c’è un “ma”, come spesso accade nella ricerca. Fino ad oggi, identificare con certezza e rapidità quali tumori avessero effettivamente questi difetti funzionali non era così semplice. I test diagnostici attuali si basano spesso sull’analisi della sequenza dei geni (cercando mutazioni note come quelle in BRCA1/2) o sull’osservazione di “cicatrici” genomiche lasciate dai difetti. Questi metodi, però, possono richiedere settimane, non sempre riflettono lo stato funzionale reale della riparazione del DNA (magari un gene è silenziato epigeneticamente e non per mutazione!) e, a volte, possono perdere informazioni cruciali. Insomma, rischiavamo di non offrire la terapia giusta al paziente giusto, o di non farlo abbastanza in fretta.

HR eye e MMR eye: Come Funzionano Questi “Occhi” Speciali?

Ecco che entriamo in gioco noi con una nuova idea, che abbiamo chiamato HR eye e MMR eye. Si tratta di due metodi diagnostici che, udite udite, ci permettono di “vedere” lo stato funzionale dei sistemi HR e MMR nelle cellule tumorali prelevate dal paziente in un solo giorno! E la cosa fantastica è che non abbiamo bisogno di confrontare con tessuto sano dello stesso paziente, il che semplifica enormemente le cose.

Come ci riusciamo? In pratica, introduciamo nelle cellule tumorali (ottenute da biopsie fresche o congelate) dei pezzetti di DNA artificiale, dei “substrati”, che contengono un gene reporter (nel nostro caso, uno che produce una luce chiamata NanoLuc, o Nluc). Questi substrati sono disegnati in modo tale che il gene Nluc possa attivarsi e produrre luce solo se i meccanismi di HR o MMR della cellula sono attivi e funzionanti per “riparare” o “ricombinare” correttamente questi frammenti.

Se il sistema HR è difettoso (HRD – Homologous Recombination Deficient), vedremo poca o nessuna luce quando usiamo il substrato per HR eye. Se invece il sistema MMR è difettoso (dMMR – mismatch repair deficient), usando un substrato specifico per MMR eye che contiene delle “imperfezioni” volute, vedremo un segnale luminoso più alto del normale, perché le cellule dMMR sono meno brave a “rigettare” queste sequenze imperfette durante un processo chiamato Single-Strand Annealing (SSA).

Abbiamo sviluppato dei punteggi specifici, l’ADACHI Score per HR eye e il dMMR Score per MMR eye, che ci danno un valore numerico. Se il punteggio supera una certa soglia (nel nostro caso, >1), possiamo classificare il tumore come HRD o dMMR.

L’Occhio sulla Ricombinazione Omologa: HR eye e il Punteggio ADACHI

Parliamo prima di HR eye. Questo test si è rivelato incredibilmente utile. Non solo ci dice se un tumore è HRD, ma abbiamo visto che l’ADACHI Score ha una correlazione lineare con la sensibilità delle cellule tumorali agli inibitori di PARP (come olaparib) e agli inibitori di PolQ, un’altra promettente classe di farmaci per i tumori HRD. Più alto è il punteggio ADACHI, più sensibile sembra essere il tumore a queste terapie! Questo è un passo avanti enorme, perché potrebbe aiutarci a prevedere l’efficacia del trattamento.

Una delle scoperte più entusiasmanti fatte grazie a HR eye riguarda una mutazione nel gene RAD51D. Un campione di tumore ovarico era stato classificato come “non HRD” (HRP, proficient) dai test standard. Tuttavia, il nostro HR eye dava un punteggio ADACHI alto, suggerendo un difetto HR. Andando a fondo, abbiamo scoperto che quel tumore aveva una variante genetica in RAD51D (p.V66M) considerata “di significato incerto” o benigna. Ebbene, i nostri esperimenti hanno dimostrato che questa specifica mutazione causa effettivamente un difetto di HR, rendendo le cellule sensibili agli inibitori di PARP! Questo significa che HR eye potrebbe scovare casi di HRD che sfuggono ai test attuali, aprendo la porta a terapie mirate per più pazienti.

Abbiamo anche visto che HR eye identifica correttamente come HRD cellule con iperespressione di Myc/Mycn, un’altra causa di difetto HR che i test basati solo sulla sequenza genica non coglierebbero, e riesce a “vedere” se cellule tumorali che avevano sviluppato resistenza agli inibitori di PARP hanno riacquistato o meno la funzionalità HR.

L’Occhio sulla Riparazione degli Appaiamenti Errati: MMR eye e il Punteggio dMMR

Passiamo ora a MMR eye. Anche qui, i risultati sono stati molto promettenti. Il test riesce a identificare i tumori dMMR, che, come dicevo, sono buoni candidati per l’immunoterapia. Inoltre, i tumori dMMR sono spesso resistenti a un chemioterapico chiamato temozolomide (TMZ), usato ad esempio per i glioblastomi. Il nostro dMMR Score ha mostrato una correlazione con la sensibilità (o meglio, resistenza) al TMZ.

Un aspetto importante è che i difetti MMR possono essere causati non solo da mutazioni genetiche, ma anche da silenziamento epigenetico dei geni MMR (ad esempio, per metilazione del promotore). Questi casi sfuggirebbero a un test basato solo sul sequenziamento del DNA. MMR eye, invece, valutando la funzione, li può beccare! Abbiamo analizzato campioni di tumori cerebrali ricorrenti dopo terapia con TMZ e MMR eye ha correttamente identificato quelli diventati dMMR, anche in un caso in cui non c’erano mutazioni nei geni MMR classici ma una perdita di espressione delle proteine MLH1 e PMS2.

Dalla Provetta al Paziente: La Prova del Nove sul Campo

Naturalmente, non ci siamo fermati alle cellule in coltura. Abbiamo testato HR eye e MMR eye su un’ampia gamma di modelli:

• Linee cellulari tumorali umane di vario tipo (mammella, ovaio, pancreas, colon, cervello).
• Modelli murini CDX (Cell line-Derived Xenografts), dove cellule tumorali umane sono impiantate nei topi.
• Modelli murini PDX (Patient-Derived Xenografts), dove frammenti di tumore del paziente sono impiantati nei topi, conservando meglio le caratteristiche originali del tumore.

E, cosa più importante, abbiamo analizzato campioni di tessuto tumorale direttamente da pazienti con tumori cerebrali e tumori ovarici, ottenendo risultati in circa 25 ore dalla dissociazione del tessuto. I test funzionano sia su campioni freschi conservati a 4°C per qualche giorno, sia su campioni congelati a -80°C anche per una o due settimane! Questo è cruciale per l’applicazione clinica.

Nei tumori ovarici, ad esempio, i risultati di HR eye (specialmente una versione leggermente modificata chiamata HR eye_2) hanno mostrato una buona correlazione con un test diagnostico approvato chiamato myChoice®. Anzi, in alcuni casi, HR eye_2 sembrava essere più accurato, come nel caso della mutazione RAD51D che vi ho raccontato.

Perché Questi Nuovi Test Potrebbero Cambiare le Carte in Tavola

Allora, perché siamo così entusiasti di HR eye e MMR eye?

• Rapidità: Avere una risposta in un giorno è un vantaggio enorme, specialmente per tumori aggressivi o per pazienti in trattamento.
• Valutazione Funzionale “Diretta”: Misuriamo direttamente la capacità di riparazione, non ci basiamo su indizi indiretti. Questo ci dà un quadro più fedele della realtà biologica della cellula tumorale.
• Nessun Controllo Sano Necessario: Semplifica la logistica e l’analisi.
• Potenziale Predittivo: La correlazione dei punteggi con la sensibilità ai farmaci è un plus notevole. Potremmo non solo scegliere la terapia giusta, ma avere un’idea di quanto potrebbe essere efficace.
• Scoperta di Nuovi Biomarcatori: Come nel caso della mutazione RAD51D, questi test potrebbero aiutarci a identificare nuovi fattori che influenzano la risposta alle terapie.
• Applicabilità a Tessuti Diversi: Funzionano su campioni freschi e congelati, il che è ottimo per la routine clinica.

Certo, ci sono ancora aspetti da approfondire. L’eterogeneità intratumorale (il fatto che non tutte le cellule in un tumore siano identiche) e la cellularità tumorale (la percentuale di cellule cancerose nel campione) possono influenzare i risultati. Tuttavia, il fatto che i nostri test analizzino l’intero campione dissociato potrebbe dare una visione più “imparziale” dello stato di riparazione del tumore nel suo complesso. Abbiamo visto che HR eye tollera una contaminazione di cellule sane fino al 50% circa, e MMR eye fino al 70%, il che è abbastanza buono. Per i campioni con bassissima cellularità tumorale, magari dopo chemioterapia, si potrebbero pensare strategie aggiuntive, come usare promotori genici specifici per le cellule cancerose per esprimere il nostro reporter Nluc solo in esse.

Un Futuro Più Preciso nella Lotta Contro il Cancro

Crediamo davvero che HR eye e MMR eye possano rappresentare un passo avanti significativo per la medicina di precisione in oncologia. Poter identificare rapidamente e accuratamente i tumori con difetti di riparazione del DNA significa poter offrire a più pazienti terapie mirate che hanno maggiori probabilità di successo. Considerato che i tumori HRD e dMMR sono frequenti e possono insorgere in diversi organi, e che anche tumori inizialmente proficienti possono sviluppare questi difetti dopo alcune terapie, l’importanza di test funzionali rapidi è evidente.

La strada è ancora lunga e serviranno ulteriori studi, magari specifici per ogni tipo di tumore, per validare appieno questi metodi e portarli nella pratica clinica quotidiana. Ma la prospettiva di avere strumenti diagnostici più accurati e veloci, capaci di guidare le scelte terapeutiche in modo più efficace, è qualcosa per cui vale la pena lavorare con passione ogni giorno. Chissà, forse questi “occhi” speciali ci aiuteranno a vedere un futuro in cui sempre più pazienti oncologici potranno beneficiare di trattamenti personalizzati e vincenti.

Fonte: Springer Nature