Neuraminidasi dell’Influenza: Il Test Cinetico MUNANA ci Svela i Punti Deboli del Virus!

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di una faccenda che ci tocca da vicino ogni inverno: l’influenza. Ma non temete, non sarò il solito bollettino medico! Voglio portarvi dietro le quinte della ricerca, dove scienziati come me cercano di mettere i bastoni tra le ruote a questo fastidioso virus. E per farlo, a volte, dobbiamo inventarci strumenti degni di un detective scientifico.

L’Influenza A: Un Nemico Sfuggente

L’Influenza A è un osso duro, diciamocelo. Ha questa fastidiosa abitudine di cambiare continuamente, un po’ come un trasformista, rendendo i vaccini annuali una corsa contro il tempo. La maggior parte dei vaccini attuali prende di mira una proteina chiamata emoagglutinina (HA), che è come la chiave che il virus usa per entrare nelle nostre cellule. Però, l’efficacia di questi vaccini può variare, e quindi stiamo sempre con le antenne dritte per trovare nuovi bersagli.

Ed è qui che entra in gioco un’altra proteina virale, la neuraminidasi (NA). Immaginatela come le forbici che il virus usa per tagliare i legami che lo tengono attaccato alla cellula infetta, permettendo così ai nuovi virus prodotti di andarsene in giro a fare altri danni. La NA è la seconda proteina più abbondante sulla superficie del virus e, cosa molto interessante, tende a essere più conservata rispetto all’HA. Questo significa che cambia meno frequentemente, il che la rende un bersaglio potenzialmente più stabile per farmaci e vaccini. Infatti, farmaci che inibiscono la NA, come oseltamivir e zanamivir, sono già usati con successo.

Anticorpi Contro la Neuraminidasi: Una Nuova Speranza?

Gli anticorpi, i nostri soldati del sistema immunitario, possono combattere l’influenza in modi diversi. Quelli contro l’HA bloccano l’ingresso del virus nelle cellule. Quelli contro la NA, invece, agiscono principalmente limitando la diffusione del virus e riducendo la gravità della malattia, anche se possono pure ostacolare l’infezione iniziale. L’idea è che anticorpi specifici per la NA (li chiameremo mAbs, anticorpi monoclonali, perché sono tutti uguali e super specifici) potrebbero offrire una protezione più duratura e ad ampio spettro.

Il problema è che, mentre conosciamo abbastanza bene i “punti caldi” (epitopi antigenici) dell’HA a cui si legano gli anticorpi, quelli della NA sono molto meno definiti. E capire dove si legano esattamente gli anticorpi è cruciale per sviluppare vaccini di nuova generazione.

Il Detective Cinetico: Il Saggio MUNANA

Per studiare come gli anticorpi inibiscono la NA, usiamo dei test di laboratorio. Tra questi ci sono il saggio MUNANA, il NA-Star e l’ELLA (enzyme-linked lectin assay). Il saggio MUNANA e NA-Star usano piccoli substrati che emettono luce (fluorescente o chemiluminescente) quando vengono processati dalla NA. Sono ottimi per testare i farmaci, perché i farmaci sono piccoli e competono bene con questi substrati. L’ELLA, invece, usa una proteina più grossa e “appiccicosa” (la fetuina) come substrato, ed è più sensibile per rilevare l’inibizione da parte degli anticorpi, che sono anch’essi molecole grandi.

Il saggio MUNANA può essere fatto in due modi:

• Endpoint: Misura un valore chiamato IC50, che ci dice quanto anticorpo serve per dimezzare l’attività della NA. Più basso è l’IC50, più potente è l’anticorpo. Utile, ma non ci dice come l’anticorpo sta bloccando la NA.
• Cinetico: Questo è il vero colpo di genio! Invece di guardare solo il risultato finale, seguiamo la reazione enzimatica nel tempo. Questo ci permette di calcolare due parametri fondamentali della famosa curva di Michaelis-Menten: Km e Vmax.

Km ci dice quanto “affamato” è l’enzima per il suo substrato (la sua affinità), mentre Vmax ci dice quanto velocemente può lavorare quando è sazio. Analizzando come un anticorpo modifica Km e Vmax, possiamo capire il meccanismo con cui sta interferendo con la NA. È un po’ come capire se un ladro scassina la serratura (cambia Km) o se rompe gli attrezzi dell’operaio (cambia Vmax).

La Nostra Indagine: Smascherare gli Anticorpi con il MUNANA Cinetico

Nel nostro studio, abbiamo ipotizzato che usare il saggio MUNANA cinetico, insieme al tradizionale ELLA, potesse darci un quadro molto più dettagliato di come i diversi mAbs influenzano la funzione enzimatica della NA. Per testare questa idea, abbiamo creato un nuovo gruppo di mAbs specifici per la NA del ceppo influenzale PR8 (un ceppo H1N1 molto usato in laboratorio).

Per prima cosa, abbiamo immunizzato dei topolini con il virus PR8 e poi con una versione ricombinante della NA (rNA) per stimolare una forte risposta anticorpale specifica. Poi, abbiamo isolato le cellule che producevano questi anticorpi e creato degli “ibridomi”, che sono come delle fabbriche immortali di un singolo tipo di mAb. Abbiamo ottenuto un pannello di 13 mAbs, che abbiamo chiamato simpaticamente NAPR8 (o NPR seguito da un numero).

Ci siamo concentrati su sei di questi, di tipo IgG2a, perché mostravano la migliore reattività con le particelle virali. Con un test chiamato ELISA competitivo, abbiamo visto che questi mAbs si legano a tre siti antigenici distinti sulla superficie della NA.

ELLA vs. MUNANA Cinetico: Due Facce della Medaglia

Abbiamo testato la capacità di questi mAbs di inibire la NA usando l’ELLA. Tutti e sei si sono dimostrati capaci di inibire, anche se con potenze diverse. Ma l’ELLA, come dicevo, non ci svela il meccanismo.

Ed ecco che entra in scena il nostro protagonista: il saggio MUNANA cinetico. E qui le cose si sono fatte davvero interessanti! Abbiamo visto che i diversi mAbs influenzavano i parametri Km e Vmax in modi molto diversi:

• NPR-05: Aumentava sia Vmax che Km. Un comportamento da “inibitore di tipo misto”. Sembra quasi che aiuti l’enzima a lavorare più velocemente a certe condizioni, ma allo stesso tempo gli renda più difficile legare il substrato.
• NPR-07: Aumentava Km senza toccare Vmax. Questo è il tipico comportamento di un “inibitore competitivo”, cioè uno che si mette in mezzo e impedisce al substrato di legarsi al sito attivo dell’enzima.
• NPR-11: Riduceva Vmax senza alterare Km. Questo è un “inibitore non competitivo”: non disturba il legame del substrato, ma una volta che l’anticorpo è legato, l’enzima lavora più lentamente o rilascia il prodotto con più difficoltà.
• NPR-06, NPR-10, NPR-12: Sorprendentemente, questi non alteravano significativamente Km o Vmax nel saggio MUNANA, nonostante avessero mostrato attività inibitoria nell’ELLA. Questo suggerisce che la loro inibizione rilevata dall’ELLA fosse dovuta a un “ingombro sterico”: in pratica, essendo grossi, impediscono alla NA di raggiungere il substrato grande (fetuina) usato nell’ELLA, ma non interferiscono direttamente con il sito attivo quando il substrato è piccolo come quello del MUNANA.

Per facilitare l’analisi di tutti questi dati cinetici, che può essere un po’ macchinosa, abbiamo anche sviluppato un’applicazione web (Shiny app) che calcola automaticamente Km e Vmax e fa pure un po’ di statistica. Un bell’aiuto!

Virus in Fuga: Mappare gli Epitopi

La cosa ancora più affascinante è stata quando abbiamo provato a selezionare dei “mutanti di fuga”, cioè versioni del virus che riuscissero a sfuggire all’azione dei nostri mAbs. Abbiamo coltivato il virus in presenza di concentrazioni crescenti di anticorpi. E indovinate un po’? Siamo riusciti a ottenere mutanti di fuga soprattutto con NPR-05 e NPR-07, proprio quelli che avevano un forte impatto sui parametri enzimatici nel saggio MUNANA cinetico, in particolare quelli che aumentavano Km!

Questi mutanti avevano delle sostituzioni amminoacidiche proprio nelle zone della NA dove si presumeva si legassero NPR-05 e NPR-07, vicino al sito attivo dell’enzima. E non è tutto: quando abbiamo “ricostruito” questi virus mutanti e testato la loro NA, abbiamo visto che la sua attività enzimatica era spesso ridotta o alterata. In pratica, per sfuggire a questi anticorpi, il virus doveva pagare un prezzo in termini di efficienza della sua stessa neuraminidasi. Questo è importantissimo, perché suggerisce che NPR-05 e NPR-07 colpiscono dei punti funzionalmente critici della NA.

Per gli altri mAbs (NPR-06, NPR-10, NPR-11, NPR-12), non siamo riusciti a isolare veri mutanti di fuga nella NA. Questo non significa che non siano utili, ma che forse il virus ha più modi per aggirare la loro azione, o che i loro epitopi sono meno cruciali.

Cosa Abbiamo Imparato (e Cosa Significa per il Futuro)

Questo studio ci ha mostrato che combinare l’ELLA con il saggio MUNANA cinetico è un approccio potente per caratterizzare gli anticorpi anti-NA. Possiamo classificarli in:

• Non-inibitori: Non fanno nulla in nessuno dei due test.
• Inibitori sterici: Bloccano l’interazione con substrati grandi (attivi in ELLA) ma non toccano il sito attivo (inattivi o poco attivi nel MUNANA cinetico). NPR-06, NPR-10, NPR-12 rientrano qui.
• Inibitori funzionali: Modificano proprio le proprietà enzimatiche del sito attivo della NA (attivi nel MUNANA cinetico). NPR-05, NPR-07, NPR-11 sono i nostri campioni.

Il saggio MUNANA cinetico ci permette poi di suddividere ulteriormente gli inibitori funzionali in base al loro meccanismo (competitivo, non competitivo, misto).

La scoperta chiave è che gli anticorpi che aumentano Km nel saggio MUNANA cinetico (come NPR-05 e NPR-07) sembrano mirare a epitopi funzionalmente molto importanti, vicini al sito attivo della NA. Le mutazioni in queste regioni, necessarie al virus per sfuggire, spesso compromettono l’attività enzimatica del virus stesso. Questo è un indizio forte che tali anticorpi potrebbero esercitare una pressione selettiva maggiore sull’evoluzione del virus, rendendo più difficile l’emergere di varianti resistenti e pienamente funzionali.

Certo, ci sono delle limitazioni. Il nostro saggio non ci dice nulla sulle funzioni protettive mediate dalla “coda” dell’anticorpo (le funzioni Fc-dipendenti, come l’attivazione di altre cellule immunitarie). Inoltre, funziona bene solo per gli anticorpi che effettivamente alterano la funzionalità del sito attivo. E dobbiamo ancora capire come i diversi modi di inibizione della NA si traducano in protezione reale in vivo, cioè in un organismo.

Tuttavia, i nostri risultati sono entusiasmanti! Suggeriscono che il saggio MUNANA cinetico può essere uno strumento prezioso per preselezionare gli anticorpi più promettenti, quelli che hanno maggiori probabilità di indurre una risposta immunitaria duratura e di mettere seriamente in difficoltà il virus dell’influenza. È un passo avanti verso la comprensione di come colpire la neuraminidasi in modo efficace, aprendo la strada, speriamo, a vaccini antinfluenzali migliori e a più ampio spettro. E chissà, forse un giorno diremo addio all’influenza stagionale con meno preoccupazioni!

Fonte: Springer