Ka/Ks è Morto? Lunga Vita al c/µ: La Nuova Spia dell’Evoluzione Virale (Caso SARS-CoV-2)

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel cuore dell’evoluzione, un posto dove le regole cambiano velocemente come i virus che studiamo. Parleremo di come capiamo se un virus, come il nostro ormai “famoso” SARS-CoV-2, si sta adattando, diventando magari più bravo a infettarci o a sfuggire ai vaccini. Per anni, noi scienziati abbiamo avuto uno strumento preferito per questo lavoro: il rapporto Ka/Ks. Ma se vi dicessi che forse è ora di guardare oltre? Che c’è un nuovo attrezzo nella nostra cassetta, potenzialmente più potente e versatile? Preparatevi, perché stiamo per parlare del rapporto c/µ e di come sta cambiando il gioco.

Il Vecchio Re: Cos’è Ka/Ks e Perché Non Basta Più?

Immaginate il genoma di un virus come un lungo libro di istruzioni scritto con un alfabeto di sole quattro lettere (A, T, C, G nel DNA; A, U, C, G nell’RNA). Queste istruzioni vengono lette a gruppi di tre (i codoni) per costruire le proteine, i mattoni fondamentali del virus. A volte, durante la copiatura del genoma (la replicazione), avvengono degli errori, delle mutazioni. Alcune di queste cambiano l’aminoacido prodotto (mutazioni non sinonime, Ka), altre no (mutazioni sinonime, Ks).

Il rapporto Ka/Ks confronta la velocità con cui si fissano nella popolazione virale le mutazioni che cambiano le proteine (Ka) rispetto a quelle che non le cambiano (Ks). L’idea di base è semplice:

• Se Ka/Ks > 1, significa che i cambiamenti nelle proteine sono favoriti dalla selezione naturale (selezione positiva o adattativa). Il virus sta “imparando” qualcosa di nuovo.
• Se Ka/Ks < 1, i cambiamenti sono svantaggiosi e vengono eliminati (selezione purificante). Il virus cerca di mantenere le cose come stanno.
• Se Ka/Ks = 1, i cambiamenti sono neutri, né buoni né cattivi.

Sembra perfetto, no? Beh, quasi. Il grande “ma” del Ka/Ks è la sua assunzione fondamentale: presume che le mutazioni sinonime (Ks) siano sempre neutre. Cioè, che non abbiano alcun effetto sulla “fitness” del virus, sul suo successo evolutivo. Per anni abbiamo pensato che fosse più o meno così, ma le prove si accumulano: non è vero! Le mutazioni sinonime possono influenzare la velocità di produzione delle proteine, la stabilità dell’RNA e altre cose importanti. Considerarle neutre per definizione è come guidare guardando solo metà della strada.

Inoltre, Ka/Ks ha un altro limite grosso come una casa: funziona solo per le regioni del genoma che codificano proteine (le Regioni Tradotte o TR). E tutte le altre parti? Le Regioni Non Tradotte (UTR), che sono piene di segnali regolatori importantissimi per la vita del virus? Ka/Ks, semplicemente, alza le mani e dice “non è affar mio”, perché parte dal presupposto che solo le proteine contino. Un po’ miope, non trovate?

La Rivoluzione c/µ: Guardare l’Intero Quadro

Ed è qui che entriamo in scena noi, con una nuova proposta: il rapporto c/µ. L’idea è più generale e, secondo me, più elegante.

• µ (mu) è il tasso di mutazione: la frequenza con cui avvengono gli errori di copiatura nel genoma, per ogni sito, prima che la selezione naturale faccia il suo lavoro. È il materiale grezzo dell’evoluzione.
• c è il tasso di sostituzione: la velocità con cui una mutazione specifica si fissa effettivamente nella popolazione virale, dopo essere passata al vaglio della selezione. È ciò che vediamo quando sequenziamo i virus nel tempo.

Il rapporto c/µ confronta direttamente la velocità con cui le mutazioni si fissano (c) rispetto alla velocità con cui vengono generate (µ).

• Se c/µ > 1, la mutazione è vantaggiosa e la selezione la sta spingendo attivamente.
• Se c/µ < 1, la mutazione è svantaggiosa e la selezione la sta eliminando.
• Se c/µ = 1, la mutazione è neutra rispetto alla selezione.

Qual è il bello di c/µ?

1. Nessuna assunzione sulla neutralità: Non ci interessa se una mutazione è sinonima o non sinonima a priori. Misuriamo il suo destino finale. Questo ci permette di vedere se anche le mutazioni sinonime sono sotto selezione (e spesso lo sono!).
2. Universale: Funziona per qualsiasi sito nel genoma, che sia in una regione codificante (TR) o non codificante (UTR). Finalmente possiamo studiare l’evoluzione dell’intero genoma!
3. Meno dipendenze: Non richiede di scegliere a priori un modello specifico di mutazione o una tabella dei codoni (che a volte possono variare o essere influenzati dalla selezione stessa), rendendo l’analisi potenzialmente meno soggetta a bias.

Abbiamo anche derivato un’equazione matematica che lega i due mondi: c/µ = Ps*(Ks/μ) + Pa*(Ka/μ). Questa formula mostra chiaramente che Ka/Ks (che è legato a Ka/µ e Ks/µ) può dare la stessa indicazione di c/µ solo e soltanto se le mutazioni sinonime sono perfettamente neutre (cioè Ks/µ = 1). Se Ks/µ è diverso da 1 (come spesso accade), allora Ka/Ks ci racconta solo una parte della storia (l’effetto sulla proteina), mentre c/µ ci dà il quadro completo (l’effetto totale sul successo del virus, considerando tutto l’acido nucleico).

Il Test sul Campo: SARS-CoV-2 Sotto la Lente c/µ

Le idee sono belle, ma funzionano nella pratica? Per scoprirlo, abbiamo preso migliaia di sequenze genomiche di SARS-CoV-2 raccolte nei primi 19 mesi della pandemia e abbiamo applicato sia il vecchio Ka/Ks che il nostro nuovo c/µ. I risultati sono stati illuminanti!

Prima di tutto, abbiamo dovuto stimare µ, il tasso di mutazione “grezzo”. Non è facile misurarlo direttamente, quindi abbiamo usato un trucco: abbiamo cercato il segmento del genoma che evolveva più velocemente pur mantenendo un “orologio molecolare” costante (cioè un tasso di sostituzione regolare nel tempo, un segno di neutralità o di selezione bilanciata). Abbiamo usato il tasso di questo segmento (la 5’UTR di Orf1ab) come stima (probabilmente una stima per difetto) di µ. Sorprendentemente, questo valore era molto coerente con le stime ottenute da esperimenti di laboratorio *in vitro*!

Poi abbiamo confrontato le analisi. Ebbene, abbiamo scoperto che per SARS-CoV-2:

• Le mutazioni sinonime non sono affatto neutre! In nessuna delle 25 proteine analizzate abbiamo trovato Ks/µ = 1. Erano quasi tutte sotto selezione purificante (Ks/µ < 1). L'assunzione base di Ka/Ks, quindi, non reggeva per questo virus.
• Anche le regioni non codificanti (UTR e TRS) sono sotto selezione! Quasi nessuna di queste regioni mostrava un c/µ = 1. Molte erano sotto selezione purificante, evidenziando il loro ruolo cruciale.
• Ka/Ks sbaglia la diagnosi! Proprio perché ignora l’effetto delle mutazioni sinonime non neutre, Ka/Ks ha classificato in modo errato il tipo di selezione (positiva, negativa o neutra) per ben 7 proteine su 25 rispetto a quanto indicato dal più completo c/µ. Ad esempio, per la proteina N, Ka/Ks suggeriva una selezione quasi neutra, mentre c/µ mostrava una chiara selezione negativa. Al contrario, per geni come S o Orf8, Ka/Ks indicava selezione positiva, ma l’analisi c/µ, considerando anche la forte selezione negativa sui siti sinonimi, rivelava una selezione complessivamente negativa sul gene.

Questo dimostra che affidarsi solo a Ka/Ks può essere fuorviante. È come giudicare la performance di un’auto guardando solo il motore e ignorando le ruote, la trasmissione e l’aerodinamica!

Perché c/µ è un Passo Avanti (Secondo Me)

Allora, perché dovreste appassionarvi a questo c/µ? Credo che i vantaggi siano tangibili:

• Visione Completa: Misura l’impatto totale di una mutazione sulla fitness, considerando sia gli effetti sulla proteina che quelli sull’acido nucleico stesso (RNA o DNA).
• Applicabilità Universale: Funziona su tutto il genoma, svelandoci l’importanza evolutiva delle regioni non codificanti, spesso trascurate.
• Maggiore Risoluzione: Permette analisi più dettagliate, come la stima della distribuzione degli effetti delle mutazioni sulla fitness (DFE) o l’identificazione di siti specifici sotto forte selezione adattativa con meno “falsi positivi”. Ad esempio, combinando c/µ > 3 con Ka/Ks > 2.5 (per mutazioni non sinonime) o Ks/µ > 3 (per quelle sinonime), abbiamo identificato mutazioni adattative chiave in SARS-CoV-2 (come la famosa D614G nella Spike, o altre in RdRp e 3CL-PRO) con grande accuratezza e coerenza con i dati sperimentali, superando i problemi tecnici di Ka/Ks quando Ks è vicino a zero.
• Meno Assunzioni Ristrette: Libera l’analisi da presupposti potenzialmente irrealistici (come la neutralità sinonima) o difficili da verificare (come specifici modelli di mutazione).

Certo, nessuna metodologia è perfetta. La sfida principale per c/µ resta la stima accurata di µ, il tasso di mutazione di base. Il nostro approccio di usare il segmento più veloce con orologio molecolare è una buona approssimazione, ma stiamo lavorando per affinarla, magari integrandola con dati sperimentali più diretti quando disponibili. Inoltre, per organismi più complessi dei virus, dove il tasso di mutazione può variare lungo il genoma, dovremo adattare il modello.

Guardando al Futuro dell’Evoluzione Molecolare

Il nostro lavoro su SARS-CoV-2 è solo l’inizio. Credo che il rapporto c/µ abbia il potenziale per diventare uno strumento standard nell’analisi dell’evoluzione molecolare, affiancando o in certi casi sostituendo il Ka/Ks. Ci permette di porre domande più profonde: quanto sono importanti le regioni non codificanti? Come interagiscono la selezione a livello di RNA e quella a livello di proteina? Come possiamo usare queste informazioni per prevedere meglio l’evoluzione virale o sviluppare terapie e vaccini più efficaci (pensate all’ottimizzazione dei codoni sinonimi nei vaccini a mRNA!)?

Stiamo già applicando c/µ ad altri virus e organismi per testarne la robustezza e generalità. È un campo di ricerca in pieno fermento, che ci costringe a ripensare alcune delle nostre certezze sull’evoluzione. È emozionante essere parte di questo cambiamento di prospettiva!

In conclusione, se Ka/Ks è stato il re indiscusso per decenni, forse è arrivato il momento di riconoscere che il suo regno ha dei limiti. Il rapporto c/µ si presenta come un principe ereditario più versatile e potente, capace di darci una visione più completa e accurata di come la vita si adatta e cambia a livello molecolare. Il viaggio nella comprensione dell’evoluzione è tutt’altro che finito, e con strumenti come c/µ, abbiamo una mappa un po’ migliore per esplorarlo.

Fonte: Springer