Fucoidani Sintetici: La Mia Caccia a un Anticoagulante Più Sicuro dal Cuore delle Alghe

Avete presente quei fastidiosi, e a volte pericolosissimi, coaguli di sangue? La trombosi, come la chiamano gli esperti, è una delle principali cause di malattie cardiovascolari, che purtroppo restano la prima causa di morte al mondo. Per fortuna, abbiamo gli anticoagulanti, farmaci essenziali per gestire questi eventi trombotici. Negli anni, oltre ai classici come l’eparina e il warfarin, ne sono stati sviluppati di nuovi, come l’enoxaparina o i più recenti anticoagulanti orali diretti. Il problema? Tutti questi farmaci, pur essendo efficaci, agiscono su fattori della coagulazione (come il fattore Xa o la trombina) che si trovano nella cosiddetta “via comune” della cascata coagulativa, essenziale anche per fermare le emorragie. Risultato: un rischio di sanguinamento non trascurabile.

Questa è una bella gatta da pelare, e noi ricercatori siamo sempre alla ricerca di alternative più sicure. Recentemente, l’attenzione si è concentrata sulla “via intrinseca” della coagulazione: sembra giochi un ruolo chiave nella formazione dei trombi, ma abbia un impatto limitato sull’emostasi (il processo che blocca le emorragie). Quindi, colpire i fattori di questa via intrinseca potrebbe essere la strategia vincente per terapie antitrombotiche più sicure ed efficaci. Ed è qui che entrano in gioco i miei protagonisti: i fucoidani.

Cosa Sono i Fucoidani e Perché Sono Speciali?

I fucoidani sono dei polisaccaridi solforati, ricchi di uno zucchero chiamato fucosio, che si trovano principalmente nella matrice extracellulare delle alghe brune. Immaginateveli come delle lunghe catene zuccherine decorate con gruppi solfato. Queste molecole sono affascinanti perché hanno dimostrato un sacco di attività biologiche interessanti: anticoagulante, antitumorale, antinfiammatoria e antivirale. L’attività anticoagulante, in particolare, è stata studiata parecchio.

Il “però” è che l’efficacia dei fucoidani come anticoagulanti varia tantissimo a seconda della specie di alga bruna da cui vengono estratti. Questo perché la loro struttura chimica è incredibilmente specifica per ogni specie, e anche molto complessa ed eterogenea. Pensate a un gomitolo di lana con fili di colori e spessori diversi, tutti aggrovigliati: ecco, i fucoidani naturali sono un po’ così. Questa eterogeneità ha reso difficile capire esattamente quale parte della molecola fosse responsabile dell’attività anticoagulante (la famosa relazione struttura-attività, o SAR) e, di conseguenza, ha frenato lo sviluppo di farmaci basati sui fucoidani. Ottenere fucoidani puri e con una struttura ben definita è una vera impresa!

La Sfida: Domare la Complessità dei Fucoidani Naturali

Per superare questo ostacolo e dare una spinta alla ricerca sui fucoidani, era fondamentale creare una collezione completa di fucoidani con strutture ben definite: diverse lunghezze, diversi tipi di legami tra gli zuccheri e, soprattutto, diversi schemi di solfatazione (cioè dove e quanti gruppi solfato sono attaccati alla catena zuccherina). Una “libreria” di questo tipo ci permetterebbe di studiare sistematicamente come queste variazioni strutturali influenzano l’attività biologica.

Negli ultimi vent’anni, sono state create diverse librerie di glicani (zuccheri complessi) per esplorarne le funzioni, e sono state sviluppate anche strategie per sintetizzare i fucoidani. Tuttavia, sintetizzare fucoidani con legami specifici (i cosiddetti legami 1,2-cisglicosidici, che sono un po’ antipatici da formare in laboratorio) e poi aggiungere selettivamente i gruppi solfato nelle posizioni giuste è rimasta una sfida notevole.

La Nostra Arma Segreta: Una Strategia di Sintesi Innovativa

Ed eccoci al cuore del nostro lavoro! Abbiamo messo a punto una strategia di sintesi chiamata “glicosilazione one-pot basata sulla preattivazione”. Sembra un nome complicato, ma l’idea è geniale: ci permette di assemblare queste catene zuccherine in modo molto efficiente, eliminando la necessità di progettare gruppi uscenti complessi e di purificare noiosamente i prodotti intermedi. In pratica, è come avere una catena di montaggio super ottimizzata per costruire i nostri fucoidani.

Partendo da 22 “scheletri” di glicani che abbiamo sintetizzato (da disaccaridi, cioè due unità di zucchero, fino a dodecasaccaridi, dodici unità!), abbiamo poi applicato modifiche selettive di solfatazione. Il risultato? Una libreria completa di 58 fucoidani solforati, che copre praticamente tutte le possibili strutture di fucoidani da due a dodici zuccheri. Una collezione del genere è, a nostra conoscenza, la più completa e sistematica mai riportata!

Questa libreria ci ha permesso di studiare in modo approfondito come l’attività anticoagulante sia correlata alla dimensione dei glicani, al tipo di legame tra gli zuccheri e ai pattern di solfatazione. E i risultati sono stati elettrizzanti!

Dentro il Laboratorio: Come Abbiamo Creato i Nostri Fucoidani

Per darvi un’idea, i fucoidani naturali si possono dividere in due tipi principali: Tipo A, con residui di L-fucopiranosio legati in α-(1,3), e Tipo B, con legami alternati α-(1,3) e α-(1,4). La nostra libreria comprende entrambi i tipi, e per ciascuno abbiamo esplorato tre diversi pattern di solfatazione: 2,3-O-di-, 3,4-O-di-, e 2,3,4-O-tri-solfatazione. Insomma, un vero e proprio campionario.

La sintesi non è stata una passeggiata. Abbiamo dovuto progettare dei “mattoncini” monosaccaridici con un gruppo uscente specifico (p-metilfeniltio, o STol) e gruppi protettori temporanei per controllare la reattività e la stereoselettività delle reazioni. La parte più tosta? Le deprotezioni selettive e le solfatazioni finali: parliamo di ben 260 passaggi per ottenere i 58 composti, con purificazioni laboriose di molecole altamente polari e cariche. Ma la strategia “one-pot” per assemblare gli scheletri glicanici ci ha fatto risparmiare un sacco di tempo e fatica.

Abbiamo usato L-fucosio, disponibile commercialmente, come punto di partenza. Poi, con una serie di reazioni chimiche, abbiamo costruito i nostri monosaccaridi “attivati” (come i composti 59, 60, 61, 62, 63). Per esempio, il gruppo benzoile (Bz) in posizione 4-O ci ha aiutato a ottenere la configurazione α desiderata nei legami glicosidici. Gruppi come il benzile (Bn), il tert-butildimetilsilile (TBS) e il p-metossibenzile (PMB) sono stati usati come “cappucci” temporanei per proteggere certi ossidrili e migliorare la reattività o permettere la solfatazione selettiva in un secondo momento.

Una volta pronti i mattoncini, abbiamo iniziato ad assemblarli. Per esempio, per creare i disaccaridi, abbiamo usato un promotore (p-TolSCl/AgOTf) e uno “spazzino” di acidi (TTBP) per far reagire un donatore glicosilico (come 60) con un accettore (come 59), ottenendo il disaccaride 64 con un’ottima resa e selettività. Abbiamo fatto lo stesso per i legami α-(1,4), anche se si sono rivelati un po’ più ostici, richiedendo temperature leggermente più alte.

Per i tetrasaccaridi e le catene più lunghe, la strategia “one-pot” è stata la vera svolta. Immaginate di aggiungere i mattoncini uno dopo l’altro nella stessa “pentola” di reazione, senza dover tirare fuori e purificare il prodotto ogni volta. Per esempio, il tetrasaccaride 72 è stato sintetizzato con una reazione “one-pot a quattro componenti [1+1+1+1]” partendo dai monosaccaridi 60 e 59, con una resa complessiva del 73%! Abbiamo usato approcci simili, a volte combinando blocchi più grandi (es. [2+1+2] o [4+2+2+2]), per costruire tutti gli scheletri glicanici fino ai dodecasaccaridi (come 96 per il Tipo A e 114 per il Tipo B).

L’ultimo, cruciale passaggio è stata la solfatazione. Qui abbiamo dovuto giocare d’astuzia con i gruppi protettori. Per esempio, per ottenere i composti 2,3-O-di-solforati, abbiamo prima rimosso i gruppi benzile (Bn) dalle posizioni 2-O, poi abbiamo aggiunto i gruppi solfato usando un reagente come SO3-NMe3, e infine abbiamo tolto i gruppi benzoile (Bz). Per i 3,4-O-di-solforati, abbiamo invertito l’ordine. I più difficili da ottenere sono stati i 2,3,4-O-tri-solforati, perché solfatare tutti gli ossidrili disponibili è complicato a causa dell’ingombro sterico e della repulsione elettrostatica. Per le catene più lunghe, ottenere una solfatazione completa è stato particolarmente impegnativo.

Il Momento della Verità: I Test Anticoagulanti

Con la nostra preziosa libreria di 58 fucoidani ben definiti in mano, eravamo pronti per la parte più emozionante: testare la loro attività anticoagulante. Abbiamo usato plasma umano e misurato tre parametri chiave:

• APTT (Tempo di Tromboplastina Parziale Attivata): valuta la via intrinseca e comune della coagulazione.
• PT (Tempo di Protrombina): valuta la via estrinseca e comune.
• TT (Tempo di Trombina): valuta la conversione finale del fibrinogeno in fibrina nella via comune.

I risultati sono stati sorprendenti! Diversi composti (25-30, 35-41, 56-58), a una concentrazione di 128 µg/mL, hanno prolungato significativamente l’APTT, almeno il doppio rispetto al controllo. In particolare, i composti 28, 29, 30, 37 e 58 sono stati i più potenti, allungando l’APTT di oltre 12 volte! Questo indica una forte inibizione della via intrinseca della coagulazione.

La cosa ancora più interessante? Alla stessa concentrazione, nessuno dei nostri 58 composti ha mostrato effetti significativi sul PT o sul TT. Questo è un dato cruciale: suggerisce che i nostri fucoidani agiscono selettivamente sulla via intrinseca, lasciando intatte la via estrinseca e quella comune. L’enoxaparina, usata come controllo positivo, invece, allungava il TT. Questa selettività è proprio quello che cercavamo, perché potrebbe tradursi in un minor rischio di sanguinamento!

Risultati da Urlo: Anticoagulanti Selettivi e Potenti

Per quantificare meglio l’effetto, abbiamo determinato la concentrazione necessaria per raddoppiare l’APTT (il valore EC2.0×). I composti 29, 30, 37 e 58 hanno mostrato una potenza notevole, con valori di EC2.0× rispettivamente di 13.6, 14.5, 16.4 e 12.9 µg/mL, paragonabili a quelli dell’enoxaparina (7.0 µg/mL).

Analizzando la relazione struttura-attività, abbiamo scoperto che:

• Per i composti di Tipo A (quelli con legami α-(1,3) ripetuti), la trisolfatazione (2,3,4-O-tri-solfatazione) aumentava significativamente l’attività anticoagulante.
• Per i composti di Tipo B (quelli con legami α-(1,3) e α-(1,4) alternati), sia la disolfatazione in posizione 2,3 che la trisolfatazione davano effetti anticoagulanti superiori.
• In generale, per i composti trisolfatati, l’attività anticoagulante aumentava con l’aumentare della dimensione molecolare.

Quindi, sia il grado di solfatazione che la connettività dei legami glicosidici, oltre alla dimensione, giocano un ruolo cruciale!

Scavando nel Meccanismo: Come Agiscono i Nostri Campioni?

Abbiamo voluto capire meglio come i nostri “campioni” (29, 30, 37 e 58) esercitassero la loro azione. Abbiamo testato il loro effetto sull’attività dell’iFXase (il complesso del fattore Xasi intrinseco), un enzima chiave nella via intrinseca. Inoltre, abbiamo valutato il loro impatto sui fattori Xa e IIa (trombina) in presenza di antitrombina (AT), dato che gli anticoagulanti simili all’eparina agiscono potenziando l’inibizione di FXa e FIIa da parte dell’AT.

Ebbene, i nostri quattro fucoidani hanno dimostrato una potente inibizione, dose-dipendente, dell’iFXase. Il composto 29, ad esempio, ha mostrato un valore di IC50 (la concentrazione che inibisce il 50% dell’attività enzimatica) di 7.4 ng/mL, molto vicino a quello dell’enoxaparina (6.7 ng/mL). Anche gli altri tre sono stati molto attivi.

Ma la vera sorpresa è arrivata quando abbiamo testato l’inibizione di FXa e FIIa in presenza di AT: i nostri composti non hanno mostrato alcuna attività inibitoria significativa (IC50 > 5000 ng/mL)! Al contrario, l’enoxaparina inibiva potentemente entrambi. Questo significa che i nostri fucoidani inibiscono la via intrinseca bersagliando selettivamente l’iFXase in modo indipendente dall’antitrombina. Un meccanismo d’azione distinto da quello delle eparine!

Sicurezza Prima di Tutto: Sono Tossici?

Un farmaco, per quanto efficace, deve essere sicuro. Abbiamo testato la citotossicità dei nostri quattro composti migliori su due linee cellulari (RAW246.7 e NIH 3T3). I risultati sono stati ottimi: anche a concentrazioni elevate (128 µg/mL), i composti hanno mostrato una citotossicità trascurabile. Questo è un buon segno per le loro potenziali applicazioni future.

Cosa Significa Tutto Questo? Prospettive Future

Il nostro lavoro ha portato alla creazione della più completa libreria di fucoidani solforati strutturalmente definiti mai realizzata. Questo ci ha permesso di svelare importanti relazioni struttura-attività che prima erano poco chiare. Abbiamo identificato composti (29, 30, 37 e 58) con eccezionali proprietà anticoagulanti, paragonabili a farmaci già in uso come l’enoxaparina, ma con un meccanismo d’azione unico: la modulazione selettiva della via intrinseca della coagulazione.

Questo approccio mirato promette una maggiore precisione nella terapia anticoagulante, con un profilo terapeutico potenzialmente più sicuro e controllabile. La specificità non solo riduce i rischi di sanguinamento, ma offre anche vantaggi per trattamenti su misura in particolari popolazioni di pazienti e situazioni cliniche. Mentre gli anticoagulanti convenzionali offrono un’inibizione ad ampio spettro, le molecole che abbiamo sviluppato aprono la strada a strategie di trattamento più personalizzate e adattabili.

Questa ricerca sottolinea l’enorme potenziale delle molecole di derivazione marina come fonte d’ispirazione per nuovi farmaci, espandendo gli orizzonti della scoperta farmaceutica e dell’innovazione terapeutica. C’è ancora molta strada da fare, ovviamente, ma i risultati sono incredibilmente promettenti. Chissà, forse un giorno avremo anticoagulanti più sicuri grazie a queste meravigliose molecole provenienti dal mare!

Fonte: Springer Nature