Sindrome di Kabuki: Svelato un Nuovo Mistero nel DNA Grazie a una Firma Inaspettata

Ciao a tutti! Oggi voglio raccontarvi una storia affascinante che arriva direttamente dal mondo della ricerca genetica, una di quelle scoperte che ti fanno dire “Wow!”. Parliamo di come, a volte, per trovare una risposta bisogna guardare le cose da una prospettiva completamente nuova, quasi come fare un passo indietro per vedere meglio il quadro generale. In questo caso, il “quadro” è il nostro DNA e la “risposta” riguarda una condizione genetica rara chiamata Sindrome di Kabuki di tipo 1 (KS1).

Cos’è la Sindrome di Kabuki e Perché è un Puzzle Diagnostico?

La Sindrome di Kabuki di tipo 1 è una condizione genetica che si riconosce abbastanza bene dai tratti del viso caratteristici, associati a ritardo nello sviluppo neurologico, crescita più lenta dopo la nascita, microcefalia e, a volte, malformazioni o problemi autoimmuni. Sappiamo che la causa principale sta in varianti patogenetiche (cioè “errori” nel codice genetico) all’interno di un gene chiamato KMT2D. Questo gene è super importante perché produce una proteina che fa parte di un complesso (il KMT2D/MLL4-COMPASS) fondamentale per regolare l’espressione di altri geni durante lo sviluppo embrionale, agendo come un interruttore epigenetico attraverso la metilazione degli istoni (in particolare H3K4me1).

Il problema? A volte, anche se un bambino presenta tutti i segni tipici della KS1, i test genetici standard, come il sequenziamento di nuova generazione (NGS) che analizza il gene KMT2D (e un altro gene associato, KDM6A), tornano indietro… vuoti. Nessuna variante patogenetica trovata. E qui inizia il nostro mistero. Cosa succede quando i sintomi ci sono tutti, ma la causa genetica sembra nascondersi?

L’Indizio Nascosto: Le Firme Epigenetiche del DNA

Negli ultimi anni, noi ricercatori abbiamo scoperto qualcosa di potentissimo: le cosiddette “firme epigenetiche” o “episignature”. Immaginate il DNA come un libro di istruzioni enorme. L’epigenetica, e in particolare la metilazione del DNA, è come se qualcuno usasse degli evidenziatori o delle note adesive su specifiche pagine per dire alla cellula quali istruzioni leggere e quali ignorare in un dato momento. Per alcune malattie genetiche, questo schema di “evidenziazioni” (metilazione) è così unico e costante da diventare una vera e propria firma.

Queste episignature si stanno rivelando strumenti diagnostici incredibilmente affidabili. Possono aiutarci a diagnosticare condizioni genetiche congenite, a capire se una variante genetica dal significato incerto (VUS) è davvero problematica, e a dare finalmente una risposta a persone che per anni non hanno avuto una diagnosi molecolare chiara. Pensate che hanno già aiutato a risolvere quasi il 19% dei casi precedentemente irrisolti!

Il Caso Che Ha Cambiato Tutto: Dalla Firma al Gene

Ed eccoci al cuore della nostra storia. Ci siamo trovati di fronte a un ragazzo con tutte le caratteristiche classiche della KS1: tratti del viso tipici, ritardo globale dello sviluppo, bassa statura, problemi cardiaci e scheletrici fin dalla nascita. La diagnosi clinica sembrava chiara fin dai tre anni. Eppure, sia un pannello genetico mirato (nel 2010) sia un sequenziamento dell’esoma dell’intera famiglia (nel 2013) non avevano trovato nulla di anomalo nei geni KMT2D o KDM6A. Un vero rompicapo.

Cosa fare? Abbiamo deciso di giocare la carta dell’episignatura. Abbiamo analizzato il profilo di metilazione del DNA del ragazzo usando un test clinicamente validato chiamato EpiSign™. E… bingo! Il risultato è stato chiarissimo: il suo profilo di metilazione corrispondeva perfettamente a quello tipico della Sindrome di Kabuki, distinguendosi nettamente dai profili di controllo e da quelli di altre sindromi genetiche. Avevamo la “firma”, una prova forte che il problema doveva essere lì, nel pathway di KMT2D/KDM6A.

La “Genotipizzazione Inversa”: Tornare Indietro per Andare Avanti

Questa scoperta ci ha dato l’impulso decisivo. Se la firma epigenetica dice “Kabuki”, allora la causa genetica *deve* esserci, magari nascosta in un modo che i metodi standard non riescono a vedere. Così, abbiamo fatto quella che chiamiamo “genotipizzazione inversa”: siamo tornati ad analizzare i dati grezzi del sequenziamento del pannello genetico fatto anni prima, ma questa volta con occhi diversi e un obiettivo preciso: cercare qualcosa di insolito proprio nel gene KMT2D.

Armati di software di visualizzazione genomica (come l’IGV), abbiamo riesaminato meticolosamente i dati. Ed ecco che l’abbiamo vista: una piccola anomalia nell’esone 36 di KMT2D. C’erano delle “letture” del sequenziamento che sembravano “tagliate” in modo strano (soft-clipped reads) e delle sequenze ripetute di basi T (poli-T), associate a una copertura di lettura più alta del normale in quella zona. Indizi sottili, ma sospetti.

Svelato l’Intruso: Un Elemento Alu nel Posto Sbagliato

Abbiamo estratto virtualmente la sequenza “alternativa” da questi dati anomali e l’abbiamo analizzata con uno strumento chiamato RepeatMasker. Il risultato? Corrispondenza al 100% con un elemento Alu, per la precisione un AluY, lungo circa 281 paia di basi.

Cosa sono gli elementi Alu? Sono dei “copia-incolla” genetici, pezzi di DNA chiamati retrotrasposoni (della famiglia SINE) che possono letteralmente “saltare” da un punto all’altro del genoma usando un meccanismo complesso (la trascrizione inversa primerizzata dal bersaglio, o TPRT). Ne abbiamo oltre un milione di copie nel nostro genoma! Di solito sono innocui, ma se uno di questi elementi si inserisce nel bel mezzo di un gene importante… beh, può fare danni.

Per confermare la nostra scoperta “in silico”, abbiamo fatto una semplice PCR sull’esone 36 del gene KMT2D nel ragazzo e nei suoi genitori sani. Il risultato è stato netto: il ragazzo aveva una copia normale del gene e una copia più lunga, esattamente della dimensione prevista per l’inserzione dell’Alu. I genitori avevano solo la copia normale. Questo significava che l’inserzione era avvenuta de novo, cioè era una mutazione nuova, non ereditata. Analizzando i punti di rottura dell’inserzione, abbiamo caratterizzato la sequenza completa inserita: 335 paia di basi, comprendenti l’elemento AluY (281 bp), la sua “coda” poli(A) (38 bp) e una piccola duplicazione del sito di inserzione (TSD, 16 bp), tipica di questo meccanismo.

Questa inserzione nell’esone 36 causa uno slittamento del frame di lettura (frameshift), portando a un codone di stop prematuro. In pratica, la proteina KMT2D prodotta da questa copia del gene è troncata e non funzionante (loss-of-function). Questa variante, p.(Lys3436Glyfs*40), è stata classificata come patogenetica (classe 5) secondo le linee guida ACMG/AMP, soddisfacendo criteri robusti (PVS1, PS2, PM2, PP4). È la prima volta in assoluto che un’inserzione di un elemento Alu viene documentata come causa della Sindrome di Kabuki!

Perché Era Sfuggita? Lezioni per il Futuro

Ma perché questa inserzione non era stata vista prima? Probabilmente perché nel 2010 e 2013, gli algoritmi bioinformatici usati per analizzare i dati NGS non erano ottimizzati per rilevare questo tipo di variazioni strutturali atipiche, come le inserzioni di elementi mobili (MEIs). Oggi esistono strumenti specifici, come MELT, progettati proprio per scovare questi “intrusi”.

Guardando al futuro, tecnologie come il sequenziamento a lettura lunga (LRS) e la mappatura ottica del genoma (OGM) promettono di essere ancora più potenti nell’identificare riarrangiamenti complessi e MEIs che sfuggono ai metodi a lettura corta. Queste tecnologie stanno diventando sempre più cruciali per risolvere i casi diagnostici più difficili e aprire la porta a una medicina di precisione anche per le malattie rare.

Cosa Portiamo a Casa da Questa Storia?

Questa scoperta è importante per diversi motivi:

• Sottolinea l’importanza di non arrendersi di fronte a dati di sequenziamento inconcludenti, specialmente quando il quadro clinico è molto suggestivo per una specifica malattia. Rianalizzare i vecchi dati con nuovi strumenti e nuove conoscenze può portare a diagnosi inaspettate.
• Dimostra ancora una volta la potenza delle firme epigenetiche come strumento diagnostico robusto, capace di guidarci nella giusta direzione quando le analisi genetiche standard falliscono.
• Amplia il panorama delle cause genetiche della Sindrome di Kabuki di tipo 1, includendo ora anche le inserzioni di elementi Alu come meccanismo molecolare possibile.
• Ci ricorda che il nostro genoma è dinamico e che meccanismi come le inserzioni di elementi mobili, anche se rari, possono avere un impatto significativo sulla salute.

Insomma, è stata una vera e propria indagine genetica, partita da un sospetto clinico forte, passata attraverso un vicolo cieco diagnostico, illuminata da una firma epigenetica e risolta tornando a guardare vecchi indizi con occhi nuovi. Una bella dimostrazione di come la perseveranza e l’integrazione di diverse tecnologie possano fare la differenza nella diagnosi delle malattie rare.

Fonte: Springer