SHOC2 e RAS: Ho Trovato il Tallone d’Achille dei Tumori RAS-Mutati?

Ciao a tutti, appassionati di scienza e curiosi! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio entusiasmante nel cuore della ricerca oncologica, un campo dove ogni piccola scoperta può accendere una grande speranza. Parleremo di un nemico che conosciamo fin troppo bene, il cancro, e di come stiamo cercando nuove armi per combatterlo, soprattutto quando si presenta con certe “firme” genetiche particolarmente ostiche: le mutazioni dei geni RAS.

Pensate ai geni RAS (HRAS, NRAS e KRAS) come a degli interruttori generali per la crescita e la divisione cellulare. Quando funzionano bene, tutto fila liscio. Ma quando una mutazione li blocca in posizione “ON”, le cellule iniziano a proliferare senza controllo, dando origine ai tumori. Queste mutazioni sono tra le più frequenti nei tumori umani e, per molto tempo, sono state considerate “indruggibili”, un vero incubo per ricercatori e pazienti.

Una Breccia nel Muro: I Primi Successi e le Sfide Aperte

Negli ultimi anni, finalmente, qualche crepa in questo muro ha iniziato a vedersi. Abbiamo assistito allo sviluppo di farmaci che riescono a colpire specifiche mutazioni di KRAS, come KRAS(G12C) e KRAS(G12D), con risultati promettenti e dosi tollerabili. È stata una vera rivoluzione, credetemi! Ma la battaglia è lungi dall’essere vinta. Ad esempio, per le mutazioni NRAS(Q61*), particolarmente frequenti nel melanoma (pensate che sono il secondo driver oncogenico più comune in questa malattia!), mancano ancora terapie mirate efficaci. Un vuoto terapeutico enorme, che colpisce decine di migliaia di persone ogni anno solo negli Stati Uniti e in Europa.

Ogni mutazione RAS, vedete, ha le sue particolarità. Anche se tutte tendono a mantenere la proteina RAS in uno stato attivo, l’intensità e le conseguenze possono variare. Alcune, come le G12C/D, mantengono una certa attività di “spegnimento” (idrolisi del GTP) e dipendono da segnali a monte per restare attive. Altre, come le Q61*, sono più “bloccate” in modalità ON. Queste differenze biochimiche e conformazionali possono tradursi in diverse interazioni cellulari e, quindi, in diverse vulnerabilità. Ed è proprio qui che si annida la possibilità di trovare nuovi bersagli!

La Scoperta di SHOC2: Un Alleato Inaspettato (per il Tumore!)

Nel nostro lavoro, ci siamo chiesti: esistono delle dipendenze specifiche per i tumori con mutazioni RAS(Q61*)? Per scoprirlo, abbiamo usato un modello cellulare ben consolidato, le cellule Ba/F3, ingegnerizzandole per esprimere diverse mutazioni di KRAS e NRAS (G12C, G12D, Q61R). Poi, armati di una libreria sgRNA genomica (una sorta di “set di chiavi” per spegnere selettivamente i geni), siamo andati a caccia di geni la cui assenza fosse letale per queste cellule tumorali.

I risultati sono stati illuminanti! Mentre le cellule con mutazioni G12C/D mostravano una dipendenza da proteine che promuovono lo stato attivo di RAS (come IGF1R, PTPN11, SOS1), un risultato emerso con forza per le cellule con mutazioni NRAS/KRAS(Q61R) è stato SHOC2. Questa proteina adattatrice fa parte di un complesso chiamato SMP (SHOC2–MRAS–PP1C), che ha un ruolo cruciale: “sbloccare” le proteine RAF (defosforilandole in un sito specifico, S259), permettendo così a RAS attivo di trasmettere il segnale di proliferazione lungo la via MAPK. Immaginate SHOC2 come un facilitatore essenziale perché il segnale “impazzito” di RAS mutato possa propagarsi.

Abbiamo confermato questa dipendenza da SHOC2 anche analizzando un vasto database di linee cellulari tumorali umane (il Cancer Dependency Map, o DepMap). E indovinate un po’? Proprio le linee con mutazioni RAS(Q61*) mostravano una spiccata sensibilità alla perdita di SHOC2, soprattutto nei melanomi cutanei. Questo ci ha dato una grande carica: forse avevamo trovato un punto debole specifico per questi tumori difficili!

Per essere sicuri, abbiamo “spento” SHOC2 in diverse linee cellulari tumorali con mutazioni NRAS(Q61*) e KRAS(Q61*), sia umane che non. I risultati? Un blocco della proliferazione cellulare e un’inibizione della via MAPK, effetti paragonabili a quelli ottenuti silenziando direttamente il gene RAS mutato! Anche in modelli animali (xenotrapianti di melanoma), la riduzione di SHOC2 ha frenato drasticamente la crescita tumorale. Era chiaro: SHOC2 è cruciale per la sopravvivenza e la proliferazione dei tumori RAS(Q61*).

L’Interazione Fatale: SHOC2 e RAS(Q61R) Faccia a Faccia

A questo punto, la domanda era: come interagiscono esattamente SHOC2 e queste forme mutate di RAS? Sapevamo che nel complesso SMP, SHOC2 lega MRAS. Ma cosa succede quando c’è un RAS oncogenico? Studi biofisici ci hanno rivelato che le forme mutate Q61R di NRAS e KRAS, quando cariche di GTP (cioè attive), formano un complesso binario stabile direttamente con SHOC2. Questa interazione è molto più debole con le forme G12C/D o con RAS wild-type, il che spiega la maggiore dipendenza da SHOC2 osservata nei tumori Q61*.

La ciliegina sulla torta è stata la determinazione della struttura co-cristallina ai raggi X dell’interazione tra SHOC2 e NRAS(Q61R). Vedere con i propri occhi come queste due proteine si “abbracciano” è stato un momento chiave! Abbiamo scoperto che NRAS(Q61R) si lega alla superficie concava di SHOC2, in una regione simile a quella usata da MRAS. Ci sono legami salini, ponti idrogeno e interazioni idrofobiche che stabilizzano questo complesso. È interessante notare che la mutazione oncogenica R61 di NRAS forma un legame idrogeno diretto con un residuo di SHOC2 (T264), un dettaglio che potrebbe contribuire alla specificità dell’interazione.

Questa scoperta strutturale è stata fondamentale, perché ci ha mostrato che, nonostante alcune differenze, la superficie di SHOC2 che lega RAS rimane sostanzialmente la stessa, sia che si tratti di MRAS o di NRAS(Q61R). E questo apriva una possibilità concreta: trovare piccole molecole che si leghino a questa regione di SHOC2 per impedire la formazione del complesso con RAS.

La Caccia alla Molecola Giusta: Sviluppare un Inibitore

Trovare un farmaco che interferisca con le interazioni proteina-proteina (PPI) non è una passeggiata, ve lo assicuro. La superficie di SHOC2 è per lo più piatta, ma la regione che lega RAS presenta una “tasca” idrofobica, seppur con caratteristiche non ideali per legare piccole molecole (superficie limitata, residui carichi, catene laterali flessibili). Una vera sfida!

Per affrontarla, abbiamo messo in piedi uno screening ad alta processività (high-throughput screening) basato su TR-FRET, testando circa 320.000 piccole molecole. Da questo enorme set, è emerso un primo “hit”, il composto 1, capace di legarsi a SHOC2 e competere con NRAS(Q61R). Parallelamente, abbiamo condotto uno screening con peptidi macrociclici, identificando il peptide 4, un legante di SHOC2 ancora più potente. La struttura co-cristallina di SHOC2 con il peptide 4 ci ha confermato che questo si lega proprio nella tasca che avevamo identificato come sito di interazione con RAS.

Armati di queste informazioni strutturali, abbiamo iniziato un processo di ottimizzazione “structure-based”. Scomponendo e modificando il composto 1, e ispirandoci alle interazioni del peptide 4, siamo arrivati a molecole via via migliori. Un passo cruciale è stato ottenere la struttura co-cristallina di SHOC2 con uno di questi piccoli leganti, il composto (R)-5. Questa ci ha confermato che la nostra piccola molecola e il peptide 4 occupavano siti sovrapposti nella tasca di legame di RAS su SHOC2.

L’ottimizzazione ci ha infine portati al composto 6, una molecola con una potenza 10 volte superiore nei saggi biochimici. Per validare la sua specificità, abbiamo creato una versione mutata di SHOC2 (G290A) resistente al composto 6 ma ancora capace di legare RAS. Come previsto, il composto 6 non riusciva a rompere l’interazione in presenza di questa SHOC2 mutata. Inoltre, l’enantiomero del composto 6 (il composto 7, la sua immagine speculare) era inattivo. Tutte queste prove ci hanno confermato che il composto 6 agisce specificamente rompendo l’interazione SHOC2-RAS.

Il Composto 6 alla Prova dei Fatti: Risultati Promettenti

Era il momento di testare il composto 6 nelle cellule tumorali. Ebbene, in cellule di melanoma con mutazione NRAS(Q61mut), il composto 6 ha indotto un’inibizione dose-dipendente della segnalazione oncogenica di RAS, riducendo la fosforilazione di MEK ed ERK. Questo effetto era specifico per le cellule RAS-mutate, e non si osservava in cellule con mutazioni BRAF. È importante sottolineare che il composto 6 non alterava i livelli di RAS-GTP (RAS attivo), ma impediva la sua capacità di attivare la cascata a valle tramite SHOC2, come dimostrato dall’aumento dei livelli di CRAF inibito (fosfo-S259).

Analisi trascrizionali globali hanno confermato che il composto 6 modula l’espressione di geni associati alla via RAS/MAPK, in modo simile a quanto fanno altri inibitori di questa via. E, cosa fondamentale, in saggi di proliferazione 3D, il trattamento con il composto 6 ha soppresso la crescita delle cellule di melanoma RAS(Q61L) ma non di quelle BRAF(V600E).

Abbiamo anche osservato che l’inibizione di SHOC2, sia con il composto 6 che geneticamente, riduce la segnalazione MAPK in tutte le condizioni di RAS mutato (Q61L, G12D, G12C), sebbene la dipendenza in termini di proliferazione cellulare fosse maggiore nelle mutazioni Q61, seguite da G12D e G12C. Questo è coerente con la nostra ipotesi che l’interazione SHOC2-RAS sia più critica quando RAS è intrinsecamente e persistentemente attivo, come nel caso delle mutazioni Q61.

Oltre NRAS(Q61*): Implicazioni e Prospettive Future

Questi risultati, dal mio punto di vista, sono davvero entusiasmanti! Forniscono la prima dimostrazione preclinica, dalle prove genetiche alla scoperta di un “tool compound”, che colpire l’interazione SHOC2-RAS rappresenta una modalità terapeutica concreta nei tumori RAS-mutati, ortogonale agli approcci che mirano direttamente a RAS.

Perché è così importante? I farmaci anti-RAS attualmente in clinica, pur essendo innovativi, si scontrano con meccanismi di resistenza che limitano la durata della risposta tumorale. Spesso, questa resistenza coinvolge un aumento dei livelli e dell’attivazione di RAS. Avere un approccio ortogonale, che colpisca un partner essenziale come SHOC2, potrebbe offrire un modo per ottenere risposte più profonde e durature.

SHOC2, agendo come attivatore pan-RAF (cioè di tutte e tre le isoforme RAF), rappresenta un “collo di bottiglia” interessante, capace di intercettare la ridondanza presente a livello di RAS e RAF. Inoltre, la deplezione di SHOC2 in modelli animali adulti sembra ben tollerata, il che è un buon auspicio per la potenziale finestra terapeutica di futuri farmaci.

Certo, il nostro composto 6 è uno “strumento”, un punto di partenza. La sua efficienza nel penetrare le cellule e le sue proprietà farmacocinetiche necessitano di miglioramenti per poter pensare a studi in vivo con esso. Ma la strada è tracciata. Abbiamo una chiara strategia di ottimizzazione basata sulla struttura, e il chemotipo che abbiamo identificato è promettente.

Le implicazioni future potrebbero andare oltre il melanoma NRAS(Q61*). Agenti che mirano a SHOC2 potrebbero essere attivi in altre condizioni dove RAS è persistentemente carico di GTP, come le RASopatie (un gruppo di sindromi genetiche). Inoltre, studi preclinici suggeriscono che la deplezione di SHOC2 potrebbe sinergizzare con altri farmaci, come gli inibitori di MEK o di KRAS(G12C), soprattutto considerando che mutazioni RAS(Q61*) possono emergere come meccanismo di resistenza a questi ultimi.

Insomma, il lavoro che vi ho raccontato apre nuove possibilità terapeutiche nel complesso campo delle malattie guidate da alterazioni della via RAS/MAPK. È un esempio di come la ricerca di base, la comprensione dei meccanismi molecolari e la drug discovery possano convergere per affrontare sfide mediche importanti. La strada è ancora lunga, ma ogni passo avanti ci avvicina all’obiettivo: offrire nuove speranze ai pazienti.

Spero che questo piccolo spaccato del nostro mondo vi abbia affascinato quanto affascina me ogni giorno!

Fonte: Springer