SFRP1: Svelato il Freno Segreto della Rigenerazione Cutanea!

Ciao a tutti gli appassionati di scienza e curiosi! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel cuore della nostra pelle, l’epidermide. Questo strato più esterno è una meraviglia della natura, un epitelio stratificato che si rinnova continuamente, mantenendo un equilibrio delicatissimo tra la nascita di nuove cellule staminali, la loro differenziazione e la desquamazione superficiale. Pensateci: ogni giorno la nostra pelle affronta sfide come ferite, raggi UV, microbi e stress ambientali. Mantenere questo equilibrio è fondamentale per la nostra salute, ma i meccanismi molecolari che lo governano non sono ancora del tutto chiari. E qui entriamo in gioco noi!

Il Linguaggio Segreto delle Cellule della Pelle: Il Secretoma

Una parte cruciale di questa comunicazione cellulare avviene tramite le proteine secrete. Sono come messaggeri che viaggiano tra le cellule, costruiscono la matrice extracellulare (l’impalcatura che tiene tutto insieme) e organizzano le difese della pelle. Immaginate il potenziale: identificare queste proteine e capire cosa fanno potrebbe rivoluzionare il modo in cui trattiamo le malattie della pelle, che colpiscono una persona su cinque!

Finora conoscevamo circa 80 proteine secrete dai cheratinociti (le cellule principali dell’epidermide), ma sentivamo che mancava qualcosa, un quadro completo. Così, ci siamo messi all’opera. Abbiamo coltivato cheratinociti umani primari, sia in condizioni “indifferenziate” (simili alle cellule staminali) sia “differenziate” (più mature), e abbiamo analizzato il “brodo di coltura” in cui vivevano usando la spettrometria di massa. È come setacciare un fiume per trovare pepite d’oro molecolari!

Il risultato? Abbiamo identificato ben 406 proteine secrete! Un vero e proprio catalogo, che abbiamo chiamato il “secretoma dei cheratinociti umani”. Analizzando questo tesoro di dati, abbiamo visto che queste proteine sono coinvolte in tantissime funzioni vitali:

• Adesione cellulare (come le cellule si attaccano tra loro e alla matrice)
• Proliferazione (la nascita di nuove cellule)
• Migrazione (come le cellule si muovono, ad esempio per riparare una ferita)
• Proteolisi (la “digestione” controllata di altre proteine)
• Rimodellamento della matrice extracellulare
• Immunità innata (le prime difese contro i microbi)
• Trasduzione del segnale (la comunicazione tra cellule)

Confrontando le proteine secrete dalle cellule indifferenziate e differenziate, abbiamo notato profili distinti, che riflettono i cambiamenti dinamici durante la maturazione della pelle. Ad esempio, alcune proteine per costruire la matrice erano presenti solo nelle cellule giovani, mentre altre per la difesa antimicrobica comparivano solo in quelle mature. Questo amplia enormemente la nostra conoscenza del “vocabolario” segreto della pelle.

Una Caccia al Tesoro Genetica: Lo Schermo CRISPR

Tra queste 406 proteine, ne abbiamo trovate 119 che erano poco o per nulla caratterizzate nella pelle. Tante candidate interessanti! Ma come capire quali fossero davvero importanti per la rigenerazione, in particolare per il potenziale delle cellule staminali/progenitrici dell’epidermide? Studiare le proteine secrete è complicato: agiscono all’esterno della cellula, quindi un classico esperimento “knockout” (spegnere un gene) in una coltura mista potrebbe essere mascherato dalle proteine secrete dalle cellule vicine non modificate.

Abbiamo quindi sviluppato una strategia innovativa: uno schermo CRISPR basato sulla formazione di colonie. Immaginate di seminare singole cellule staminali epidermiche su uno strato di cellule “nutrici” (fibroblasti). Ogni cellula staminale capace di auto-rinnovarsi darà origine a una colonia visibile. Il nostro schermo usa la tecnologia CRISPR-Cas9 per “spegnere” specifici geni (in questo caso, quelli delle 119 proteine secrete misteriose) in un pool di cellule. Poi, seminiamo queste cellule modificate a bassa densità, in modo che le colonie crescano distanti tra loro, minimizzando l’effetto “salvataggio” dalle cellule vicine. Dopo 12 giorni, analizziamo quali guide CRISPR (sgRNA, le “forbici molecolari” che spengono i geni) sono diventate più o meno abbondanti. Se un sgRNA che spegne il gene per una proteina segreta diventa meno abbondante, significa che quella proteina normalmente promuove la formazione di colonie (la proliferazione). Se invece diventa più abbondante, significa che quella proteina normalmente frena la proliferazione.

Lo schermo ha funzionato alla grande! Abbiamo identificato 8 proteine “hit”:

• 6 promotori della proliferazione (i loro sgRNA erano meno abbondanti): RHOQ, MDK, B3GAT3, HSP90B1, ATP6AP1, ALDOA.
• 2 inibitori della proliferazione (i loro sgRNA erano più abbondanti): SFRP1 e MXRA5.

SFRP1: Il Freno a Mano della Proliferazione Epidermica

Il candidato che ci ha colpito di più è stato SFRP1 (Secreted Frizzled-Related Protein-1). Era l’inibitore più potente identificato dal nostro schermo. SFRP1 appartiene a una famiglia di proteine note per regolare la via di segnalazione Wnt, un percorso cruciale per lo sviluppo e l’omeostasi di molti tessuti, inclusa la pelle e i follicoli piliferi. Studi precedenti avevano già collegato SFRP1 ai follicoli e ad alcune condizioni come cheloidi e carcinomi cutanei, ma il suo ruolo specifico nell’epidermide interfollicolare umana (la pelle tra i peli) non era chiaro.

Per confermare i risultati dello schermo, abbiamo usato tecniche diverse per ridurre SFRP1 nelle cellule: sia con CRISPR individuale sia con shRNA (un altro metodo per silenziare i geni). In entrambi i casi, le cellule con meno SFRP1 formavano colonie più numerose e più grandi. Analizzando queste colonie più grandi, abbiamo visto che non c’era più morte cellulare (apoptosi), ma c’era molta più proliferazione, specialmente ai bordi in espansione delle colonie (marcatore Ki-67). E la ciliegina sulla torta: aggiungendo SFRP1 ricombinante (prodotta in laboratorio) alle cellule in cui l’avevamo spenta, l’effetto di iper-proliferazione veniva annullato! Questo confermava che era proprio la mancanza di SFRP1 secreta a causare l’aumento della crescita.

SFRP1 nel Contesto: Dalle Cellule Singole agli Organoidi e alle Malattie

Ma dove si trova SFRP1 nella pelle vera e propria? Abbiamo analizzato dati di sequenziamento di RNA da singola cellula (scRNA-seq) di pelle neonatale umana. Abbiamo visto che SFRP1 è espresso principalmente nello strato basale dell’epidermide, quello che contiene le cellule staminali/progenitrici. Ancora più interessante, all’interno dello strato basale, SFRP1 si trovava quasi esclusivamente nelle cellule non proliferanti (Ki-67 negative), mentre era assente in quelle in attiva divisione. Sembra proprio che SFRP1 segni una sottopopolazione di cellule basali quiescenti e che la sua repressione possa “svegliarle” e farle proliferare.

Per testare questa idea in un contesto più fisiologico, abbiamo creato degli organoidi epidermici: in pratica, abbiamo fatto crescere i cheratinociti (con o senza SFRP1) su un pezzo di derma umano devitalizzato, creando una mini-pelle tridimensionale in laboratorio. Il risultato? Negli organoidi senza SFRP1, lo strato basale era molto più “affollato” e ondulato, con accumuli di cellule ipercellulari e un aumento significativo delle cellule positive per Ki-67 (proliferanti). La differenziazione degli strati superiori sembrava invece meno influenzata, suggerendo che SFRP1 agisca principalmente come freno sulla proliferazione basale.

Questo ci ha fatto pensare: se SFRP1 frena la proliferazione, la sua mancanza potrebbe essere coinvolta in malattie caratterizzate da crescita eccessiva? Abbiamo analizzato dati pubblici di espressione genica da pazienti. Ed ecco la conferma: i livelli di SFRP1 erano significativamente più bassi nel carcinoma squamocellulare (un tipo di cancro della pelle) e nella psoriasi (una malattia infiammatoria con iperproliferazione epidermica) rispetto alla pelle sana. Nell’eczema, invece, non c’erano differenze significative. Questo collega direttamente i nostri risultati di laboratorio a condizioni cliniche rilevanti.

Svelare il Meccanismo: Wnt, LIF e Oltre

Come fa SFRP1 a frenare la proliferazione? Sapevamo del suo legame con la via Wnt. Per capirne di più, abbiamo fatto sequenziamento dell’RNA (RNA-seq) e ATAC-seq (che mappa le regioni accessibili del DNA, indicando quali geni potrebbero essere attivi) nelle cellule con e senza SFRP1.

L’RNA-seq ha confermato che spegnere SFRP1 altera l’espressione di molti geni legati alla via Wnt, come ci aspettavamo. Ma ha anche rivelato cambiamenti in geni legati alla regolazione delle cellule staminali. Tra questi, uno ha catturato la nostra attenzione: LIF (Leukemia Inhibitory Factor). LIF è una citochina nota per influenzare crescita e differenziazione, e la sua sovraespressione nella pelle era stata collegata a iperplasia e tumori. Nei nostri esperimenti, LIF era quasi indetectabile nelle cellule normali, ma la sua espressione (sia RNA che proteina) aumentava drasticamente quando SFRP1 veniva spento! L’ATAC-seq ha mostrato che la regione del DNA corrispondente al gene LIF diventava più accessibile, suggerendo un’attivazione diretta o indiretta.

Era un colpo di scena! LIF non era classicamente collegato alla via Wnt/SFRP1. Poteva essere che l’effetto di SFRP1 sulla proliferazione fosse mediato, almeno in parte, da questa induzione “ectopica” (fuori luogo) di LIF? Abbiamo fatto altri esperimenti:

• Spegnere solo LIF non aveva grandi effetti sulla formazione di colonie.
• Aggiungere LIF ricombinante aumentava la formazione di colonie.
• Spegnere sia SFRP1 che LIF riduceva parzialmente l’aumento di proliferazione causato dalla sola mancanza di SFRP1.

Questo indicava che LIF contribuiva all’effetto, ma non lo spiegava completamente. E la via Wnt? Abbiamo spento SFRP1 e contemporaneamente beta-catenina (CTNNB1), il mediatore chiave della via Wnt canonica. Spegnere beta-catenina bloccava parzialmente sia l’induzione di LIF sia l’aumento di formazione di colonie causati dalla mancanza di SFRP1.

Conclusioni e Prospettive Future

Mettendo insieme tutti i pezzi, emerge un quadro affascinante: SFRP1 agisce come un guardiano dell’equilibrio epidermico, frenando la proliferazione delle cellule progenitrici basali. Lo fa principalmente attraverso la sua nota funzione di inibitore della via Wnt, ma abbiamo scoperto che contribuisce anche sopprimendo l’espressione ectopica di LIF, un meccanismo finora sconosciuto.

Questo studio non solo ci ha fornito il catalogo più completo del secretoma dei cheratinociti umani, ma ha anche introdotto un nuovo potente strumento (lo schermo CRISPR basato su colonie) per studiare la funzione delle proteine secrete. L’identificazione di SFRP1 come inibitore chiave, con il suo doppio meccanismo d’azione su Wnt e LIF, apre nuove strade per capire malattie come la psoriasi e il cancro della pelle, dove i suoi livelli sono ridotti. Potrebbe SFRP1 stesso, o molecole che ne mimano l’azione, diventare un giorno una nuova terapia? O potrebbe essere un utile biomarcatore?

Il nostro viaggio nel linguaggio segreto della pelle è appena iniziato, ma aver identificato un “freno” così importante come SFRP1 è un passo fondamentale per comprendere e, speriamo, un giorno controllare meglio la straordinaria capacità rigenerativa della nostra epidermide.

Fonte: Springer