Svelati i Segreti della Sophora tonkinensis: Il Ruolo Chiave dei Geni NAC nella Produzione di Alcaloidi e Flavonoidi

Ciao a tutti gli appassionati di scienza e natura! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel cuore di una pianta medicinale straordinaria: la Sophora tonkinensis Gagnep. Forse non ne avete mai sentito parlare, ma questa pianta è un vero tesoro della medicina tradizionale, usata da secoli per le sue proprietà antinfiammatorie e antidolorifiche. Il suo segreto? Un cocktail di composti attivi, principalmente alcaloidi come la matrina e l’ossimatrina, e flavonoidi come la genistina e la genisteina.

Ma come fa la Sophora tonkinensis a produrre queste molecole preziose? Quali sono i meccanismi genetici che ne regolano la sintesi? Ecco, è proprio qui che la nostra avventura scientifica ha inizio! Recentemente, ci siamo tuffati nel genoma di questa pianta per studiare una famiglia di geni molto speciale, i cosiddetti fattori di trascrizione NAC.

Chi sono i misteriosi NAC?

Immaginate i geni come degli interruttori che accendono o spengono specifiche funzioni nella cellula. I fattori di trascrizione sono le “dita” molecolari che premono questi interruttori. La famiglia NAC è una delle più grandi famiglie di fattori di trascrizione specifiche delle piante. Il nome “NAC” deriva dai primi membri scoperti: NAM (No Apical Meristem), ATAF1/2 (Arabidopsis thaliana Transcription Activation Factor 1/2) e CUC2 (Cup-Shaped Cotyledon 2).

Questi geni sono dei veri e propri registi molecolari: controllano la crescita e lo sviluppo della pianta, la sua risposta agli stress (come siccità o attacchi di patogeni) e, cosa che ci interessa particolarmente, la produzione di metaboliti secondari, proprio come gli alcaloidi e i flavonoidi che rendono la Sophora tonkinensis così speciale! Studi su altre piante, come il tè (Camellia sinensis) o l’Ophiorrhiza pumila, hanno già dimostrato che i geni NAC possono attivare direttamente enzimi chiave nella sintesi di flavonoidi o alcaloidi. A volte, lo fanno anche indirettamente, magari in risposta a uno stress ambientale. Insomma, sono dei giocatori fondamentali nel metabolismo vegetale.

La nostra caccia al tesoro nel genoma della Sophora

Nonostante l’importanza di questi geni, nessuno aveva ancora fatto un’analisi completa della famiglia NAC nella Sophora tonkinensis (che abbiamo chiamato StNAC, per Sophora tonkinensis NAC). Era come avere una mappa del tesoro incompleta! Così, armati di potenti strumenti bioinformatici e sfruttando i dati del genoma completo della pianta (ancora inediti!), abbiamo iniziato la nostra ricerca.

Abbiamo usato modelli computazionali (Hidden Markov Model, HMM) e confronti di sequenze (BLASTp) per scovare tutti i potenziali geni NAC nascosti nel DNA della Sophora. Dopo un’attenta verifica, per assicurarci che avessero davvero la “firma” caratteristica dei NAC (il dominio conservato NAM, tecnicamente PF02365), abbiamo identificato ben 85 geni StNAC! Un bel gruppetto, non c’è che dire.

Abbiamo poi analizzato le loro caratteristiche: quanto sono lunghi, che peso molecolare hanno le proteine che codificano, il loro punto isoelettrico (che ci dice se sono più acide o basiche), e persino dove si prevede che lavorino all’interno della cellula. La maggior parte sembra destinata al nucleo, il centro di comando della cellula, proprio dove ci si aspetta che i fattori di trascrizione facciano il loro lavoro. Altri, però, sembrano localizzati nel citoplasma, nei cloroplasti o altrove, suggerendo funzioni più specializzate. C’è una grande varietà, il che fa pensare a ruoli molto diversi per ciascuno di loro.

Un ritratto di famiglia: struttura, evoluzione e distribuzione

Una volta identificati tutti i membri della famiglia StNAC, abbiamo cercato di capire come sono imparentati tra loro e con i geni NAC di un’altra pianta modello, l’Arabidopsis thaliana. Costruendo un albero filogenetico, una sorta di albero genealogico molecolare, abbiamo visto che gli 85 StNAC si raggruppano in 15 sottogruppi distinti (chiamati C1-C15). È interessante notare che la Sophora sembra non aver perso nessun sottogruppo principale durante la sua evoluzione rispetto all’Arabidopsis, suggerendo che tutte queste funzioni NAC sono state conservate.

Abbiamo poi esaminato la struttura di questi geni. La maggior parte dei geni StNAC ha 2 o 3 introni (sequenze non codificanti che vengono rimosse prima della sintesi proteica), anche se alcuni ne hanno solo uno e uno addirittura sette! I membri dello stesso sottogruppo tendono ad avere strutture simili, suggerendo un’origine evolutiva comune. Analizzando i “motivi” conservati, cioè piccole sequenze di amminoacidi che si ripetono e hanno funzioni specifiche, abbiamo confermato quello che si sa sui NAC: la parte N-terminale (l’inizio della proteina) è molto conservata e contiene i domini chiave per legare il DNA, mentre la parte C-terminale (la fine) è molto variabile, permettendo probabilmente la specializzazione funzionale.

E dove si trovano questi geni nel genoma? Non sono distribuiti a caso! Li abbiamo mappati sui 9 cromosomi della Sophora tonkinensis. Il cromosoma 3 è il più affollato, con ben 14 geni StNAC, mentre il cromosoma 9 ne ospita solo uno. Questa distribuzione non uniforme è spesso il risultato di eventi di duplicazione genica avvenuti durante l’evoluzione.

Come si espande una famiglia di geni: il ruolo delle duplicazioni

A proposito di duplicazioni, abbiamo indagato su come la famiglia StNAC sia diventata così numerosa. Esistono due modi principali in cui i geni possono duplicarsi: la duplicazione tandem (TD), dove un gene viene copiato vicino all’originale, e la duplicazione segmentale (SD) o dell’intero genoma (WGD), dove vengono copiati interi blocchi di cromosomi. Nella Sophora tonkinensis, abbiamo trovato 4 coppie di geni StNAC derivanti da duplicazione tandem (8 geni in totale) e ben 32 coppie derivanti da duplicazione segmentale (coinvolgendo 45 geni)! Questo ci dice che è stata soprattutto la duplicazione di grandi segmenti di DNA a guidare l’espansione di questa famiglia genica.

Ma cosa succede dopo una duplicazione? A volte le due copie mantengono la stessa funzione (ridondanza), altre volte una delle copie acquisisce una nuova funzione (neofunzionalizzazione), oppure si dividono i compiti originali (subfunzionalizzazione). Analizzando l’espressione dei geni duplicati, abbiamo visto esempi di tutti questi scenari. Ad esempio, alcune coppie duplicate mostrano profili di espressione molto simili nei vari tessuti, suggerendo ridondanza. Altre coppie, invece, hanno pattern di espressione completamente diversi (uno più attivo nelle foglie, l’altro nelle radici), indicando una possibile specializzazione. È affascinante vedere come l’evoluzione plasmi le funzioni dei geni! Inoltre, calcolando il rapporto Ka/Ks (che misura la pressione selettiva), abbiamo visto che quasi tutte le coppie duplicate sono sotto forte selezione purificante (Ka/Ks < 1), il che significa che la loro sequenza è stata conservata nel tempo, probabilmente perché la loro funzione è importante.

Gli interruttori all’opera: espressione genica e legame con i metaboliti

Identificare i geni è solo il primo passo. Volevamo sapere dove e quando questi geni StNAC sono attivi. Utilizzando dati di RNA-seq (una tecnica che misura l’espressione di tutti i geni in un tessuto), abbiamo esaminato i livelli di attività degli StNAC in radici, fusti, foglie e semi.

I risultati sono stati illuminanti! La maggior parte dei geni StNAC (78 su 85) è espressa in almeno un tessuto. L’attività maggiore l’abbiamo vista nei fusti (con 49 geni altamente espressi), seguiti da radici, foglie e semi. Alcuni geni mostrano una spiccata preferenza per un tessuto: ad esempio, StNAC29 e StNAC33 sono super attivi nei semi, mentre StNAC35, StNAC30, StNAC65 e StNAC25 sembrano specializzati per le radici. Questa espressione tessuto-specifica ci dà indizi importanti sui loro ruoli specifici.

Ma ecco la parte più eccitante: abbiamo cercato una correlazione tra l’espressione di questi geni e la quantità dei preziosi alcaloidi (matrina, ossimatrina) e flavonoidi (genistina, genisteina, trifolirizina) misurata negli stessi tessuti con tecniche di HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni). Bingo! Abbiamo trovato otto geni StNAC la cui espressione è significativamente correlata ai livelli di questi metaboliti.

• Due geni (StNAC77, StNAC81) sono correlati alla matrina.
• Tre geni (StNAC24, StNAC33, StNAC83) sono correlati all’ossimatrina.
• Tre geni (StNAC32, StNAC46, StNAC79) sono correlati alla genisteina.

Questi otto geni sono diventati i nostri candidati principali come regolatori della biosintesi di alcaloidi e flavonoidi nella Sophora tonkinensis!

Per essere ancora più sicuri, abbiamo preso questi otto geni “sospetti” e abbiamo verificato i loro livelli di espressione nei diversi tessuti usando un’altra tecnica, la qRT-PCR (Real-Time Quantitative PCR), che è molto precisa per quantificare l’espressione di singoli geni. I risultati hanno confermato in gran parte quanto visto con l’RNA-seq per cinque di questi geni (StNAC24, StNAC32, StNAC33, StNAC77, StNAC83). Ad esempio, i geni legati all’ossimatrina (StNAC24, StNAC33, StNAC83) sono risultati effettivamente molto espressi nei semi, dove questo alcaloide abbonda. Il gene StNAC32, legato alla genisteina, è risultato attivo soprattutto nel fusto e nelle foglie.

Ci sono state alcune discrepanze per tre geni (StNAC46, StNAC79, StNAC81) tra RNA-seq e qRT-PCR. Questo può succedere: le tecniche sono diverse, ci può essere variabilità biologica tra i campioni, o differenze nella sensibilità dei metodi. Ma nel complesso, i dati sono molto incoraggianti!

Cosa ci dicono gli “interruttori”: i cis-elementi

Per capire ancora meglio come vengono regolati questi geni StNAC, abbiamo analizzato le regioni del DNA che si trovano “a monte” dei geni stessi, chiamate promotori. Queste regioni contengono delle brevi sequenze, i cis-elementi, che funzionano come siti di attracco per altri fattori di trascrizione, regolando l’accensione o lo spegnimento del gene.

Ne abbiamo trovati tantissimi (oltre 3000 in totale!), in media 35 per ogni gene StNAC. Molti di questi sono legati alla risposta agli ormoni vegetali (come acido abscissico, gibberelline, acido jasmonico, auxine), alla risposta agli stress (come siccità, salinità, freddo) e alla risposta alla luce. Questo conferma che i geni StNAC sono coinvolti in una vasta gamma di processi fisiologici e di adattamento ambientale.

È interessante notare che abbiamo trovato elementi specifici nei promotori dei geni con espressione tessuto-specifica. Ad esempio, i geni molto attivi nelle foglie avevano abbondanti elementi sensibili alla luce (come G-box, GT1 motif). I geni attivi nei semi avevano motivi tipici dell’espressione nei semi (RY motif, GCN4 motif). E, cosa molto rilevante per noi, nei promotori di due geni (StNAC58 e StNAC61) che sembravano negativamente correlati alla genistina, abbiamo trovato il motivo MBSI, noto per essere un sito di legame per fattori MYB coinvolti nella repressione della sintesi dei flavonoidi. Questo suggerisce che StNAC58 e StNAC61 potrebbero agire come “freni” nella produzione di genistina!

Conclusioni e prospettive future: una nuova mappa per la Sophora

Questa ricerca ci ha permesso di fare un’analisi completa e dettagliata della famiglia dei geni NAC nella Sophora tonkinensis. Abbiamo identificato 85 membri, li abbiamo classificati, ne abbiamo studiato la struttura, l’evoluzione, la distribuzione cromosomica e i meccanismi di duplicazione. Abbiamo analizzato i loro pattern di espressione nei diversi tessuti e, soprattutto, abbiamo identificato otto candidati promettenti che sembrano giocare un ruolo chiave nella regolazione della produzione dei preziosi alcaloidi e flavonoidi di questa pianta medicinale. Cinque di questi candidati hanno superato brillantemente la prova della validazione sperimentale con qRT-PCR.

Certo, la nostra avventura non finisce qui. Questi sono risultati basati su analisi computazionali e correlazioni. Il prossimo passo fondamentale sarà la validazione funzionale: dovremo usare tecniche di ingegneria genetica (come l’overespressione o il silenziamento genico con CRISPR-Cas9) per modificare l’attività di questi geni candidati direttamente nella pianta (o in sistemi modello) e vedere se questo cambia effettivamente la produzione di alcaloidi e flavonoidi. Sarà emozionante scoprire i meccanismi molecolari precisi con cui questi StNAC orchestrano la sintesi di questi composti.

Questi risultati, comunque, rappresentano già un passo avanti importantissimo. Ci forniscono una “mappa” molto più dettagliata per capire la biologia complessa della Sophora tonkinensis e aprono la strada a future applicazioni, magari per migliorare la coltivazione di questa pianta o per ottimizzare la produzione dei suoi composti bioattivi attraverso approcci biotecnologici.

Spero che questo viaggio nel mondo dei geni NAC e della Sophora tonkinensis vi abbia affascinato quanto ha affascinato noi! Continuate a seguire la scienza, perché c’è sempre un nuovo segreto della natura da scoprire!

Fonte: Springer