Viaggio nel Cuore della Placca: Sveliamo i Segreti dell’Aterosclerosi con le Nuove Tecnologie

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante, quasi da detective, all’interno delle nostre arterie. Parleremo di aterosclerosi, quel processo subdolo e silenzioso che, purtroppo, è una delle principali cause di eventi gravi come infarti e ictus nel mondo. Pensate che nel 2019, circa 15 milioni di persone hanno perso la vita proprio a causa di malattie ischemiche del cuore e ictus. Numeri impressionanti, vero?

Il problema principale dell’aterosclerosi sono le “placche”, accumuli di grasso, colesterolo, calcio e altre sostanze che si formano sulle pareti delle arterie. All’inizio, queste placche possono non dare sintomi, ma crescendo possono restringere il flusso sanguigno o, peggio ancora, rompersi improvvisamente, formando un coagulo (trombo) che blocca del tutto l’arteria. È qui che la situazione diventa critica.

Capire il Nemico: Le Fasi della Placca Aterosclerotica

Per combattere un nemico, bisogna conoscerlo bene. Gli scienziati classificano le placche aterosclerotiche in diversi stadi, seguendo la classificazione dell’American Heart Association (AHA). Noi ci concentreremo sugli stadi più avanzati, i tipi IV, V e VI, perché sono quelli più pericolosi e legati agli eventi clinici.

• Tipo IV: Qui inizia a formarsi un nucleo lipidico ben definito, ma la placca è ancora considerata relativamente stabile.
• Tipo V: La placca sviluppa una spessa “capsula” fibrosa attorno al nucleo lipidico. È più stabile del tipo IV, ma rappresenta comunque una progressione.
• Tipo VI: Questa è la placca “complicata”. Si possono verificare erosioni, emorragie interne o formazione di trombi sulla sua superficie. È la più instabile e pericolosa.

Capire cosa succede a livello molecolare quando una placca passa da uno stadio all’altro, specialmente dal tipo IV al tipo VI, è fondamentale. Ci permetterebbe di identificare precocemente le placche a rischio e, magari, sviluppare terapie per stabilizzarle prima che facciano danni.

La Lente d’Ingrandimento Molecolare: Proteomica al Servizio della Ricerca

Ed è qui che entra in gioco la tecnologia! Negli ultimi anni, tecniche potentissime come la proteomica ci stanno aiutando a “zoomare” dentro le placche e a vedere cosa succede a livello di proteine. Le proteine sono le vere operaie delle nostre cellule, svolgono quasi tutte le funzioni vitali. Studiare quali proteine sono presenti, e in che quantità, nelle diverse fasi della placca ci dà indizi preziosissimi sui meccanismi della malattia.

Nel nostro studio, abbiamo utilizzato una tecnica avanzata chiamata DIA-MS (Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry) per analizzare in dettaglio il profilo proteico di placche carotidee umane classificate come tipo IV, V e VI. Abbiamo prelevato questi campioni da pazienti sottoposti a un intervento chirurgico chiamato endoarteriectomia carotidea (CEA), ovviamente dopo aver ottenuto il loro consenso informato e l’approvazione del comitato etico.

Cosa abbiamo scoperto? Beh, innanzitutto abbiamo identificato migliaia di proteine (oltre 6000!). Ma la cosa più interessante è che abbiamo trovato differenze significative nel tipo e nella quantità di proteine tra le placche di tipo IV, V e VI. È come se ogni stadio avesse una sua “firma” proteica unica.
Analizzando queste differenze, abbiamo visto che le funzioni biologiche più coinvolte riguardano:

• La regolazione della morte cellulare (apoptosi e necrosi)
• La struttura delle cellule (citoscheletro)
• Il metabolismo
• Il trasporto molecolare
• L’infiammazione

Ad esempio, abbiamo notato che l’apoptosi (morte cellulare programmata) è più attiva nelle placche di tipo V rispetto al tipo IV, mentre la necrosi (morte cellulare “disordinata”) è molto più pronunciata nel tipo VI. Questo suggerisce che nel tipo V c’è un tentativo di controllo, mentre nel tipo VI la situazione è più caotica e dannosa.

Dalla Stabilità all’Instabilità: Il Passaggio Cruciale da Tipo IV a Tipo VI

Il momento chiave è capire cosa spinge una placca di tipo IV, relativamente stabile, a diventare una bomba a orologeria di tipo VI. Abbiamo quindi concentrato la nostra attenzione sulle proteine che mostravano differenze esclusive tra questi due stadi.

Analizzando queste proteine “chiave”, abbiamo visto che molte sono coinvolte nell’infiammazione, nella morte cellulare e nel metabolismo. Utilizzando analisi bioinformatiche (come IPA e STRING), abbiamo identificato una rete di proteine particolarmente importanti, dei veri e propri “hub” molecolari. Tra questi, cinque proteine hanno attirato la nostra attenzione:

• CD44: Aumentata nel tipo VI
• TREM2: Aumentata nel tipo VI
• SMAD3: Diminuita nel tipo VI
• IL6R (Recettore dell’Interleuchina-6): Diminuito nel tipo VI
• GAL-1 (Galectina-1): Diminuita nel tipo VI

Queste proteine sembrano giocare un ruolo cruciale nel determinare se una placca rimarrà stabile o evolverà verso la rottura.

Vedere per Credere: Conferme Visive e Localizzazione Cellulare

Identificare le proteine è importante, ma volevamo anche “vederle” all’opera dentro la placca. Per questo, abbiamo usato tecniche di immunoistochimica (IHC) e immunofluorescenza (IF) su un gruppo separato di campioni di placche (la nostra coorte di validazione). Queste tecniche usano anticorpi specifici che si legano alle proteine di interesse e le “colorano”, permettendoci di visualizzarle al microscopio.

I risultati hanno confermato quanto visto con la proteomica: CD44 e TREM2 erano effettivamente più abbondanti nelle placche di tipo VI, mentre SMAD3, IL6R e GAL-1 erano meno presenti. Ma non solo! L’immunofluorescenza multipla ci ha permesso di vedere dove si trovano queste proteine e in quali tipi di cellule. Ad esempio:

• IL6R e CD44: Si trovano sia nei macrofagi (cellule immunitarie “spazzine” che però possono contribuire all’infiammazione) sia nelle cellule muscolari lisce (CML) delle pareti arteriose. La loro localizzazione cambia a seconda dello stadio della placca. CD44 è particolarmente abbondante nelle zone ricche di macrofagi delle placche instabili (tipo VI).
• SMAD3 e GAL-1: Sono espresse principalmente nelle CML. SMAD3 sembra essere importante nelle placche più stabili (IV e V) e diminuisce nel tipo VI, forse perché le CML cambiano “identità” o vengono sostituite da macrofagi.
• TREM2: Si trova quasi esclusivamente sui macrofagi ed è molto più abbondante nelle placche di tipo V e VI, suggerendo un ruolo nell’infiammazione guidata dai macrofagi.

Queste osservazioni ci danno un quadro molto più dettagliato di come queste proteine potrebbero influenzare il comportamento della placca a livello cellulare.

Ogni Cellula Conta: L’Analisi a Singola Cellula

Per scavare ancora più a fondo, abbiamo integrato i nostri dati con analisi di transcrittomica a singola cellula (scRNA-seq) provenienti da studi precedenti su placche carotidee umane. Questa tecnica incredibile ci permette di analizzare l’espressione genica (quali geni sono “accesi” o “spenti”) cellula per cellula!

Abbiamo così potuto vedere quali tipi di cellule (CML, macrofagi, cellule T, cellule B, ecc.) esprimono i geni che codificano per le nostre cinque proteine hub. I risultati hanno in gran parte confermato le osservazioni dell’immunofluorescenza:

• TREM2 è espresso quasi solo dai macrofagi.
• SMAD3 è espresso principalmente dalle CML.
• CD44 è espresso da vari tipi di cellule immunitarie, con un’interessante alta espressione nei mastociti all’interno del nucleo aterosclerotico.
• IL6R mostra un’espressione ridotta nei macrofagi del nucleo della placca, in linea con la sua diminuzione proteica nel tipo VI.
• LGALS1 (il gene per GAL-1) è espresso ampiamente, ma i livelli proteici erano più bassi nel tipo VI, forse a causa di regolazioni che avvengono dopo la trascrizione del gene.

Questa analisi a singola cellula aggiunge un ulteriore livello di dettaglio, aiutandoci a capire quali cellule sono responsabili dei cambiamenti proteici che osserviamo.

Dalle Proteine al Rischio di Ictus: La Randomizzazione Mendeliana

Infine, ci siamo chiesti: queste proteine identificate nella placca hanno anche un legame causale con l’esito clinico finale, ovvero l’ictus ischemico? Per rispondere a questa domanda, abbiamo usato un approccio genetico chiamato Randomizzazione Mendeliana (MR).

In parole semplici, la MR sfrutta le variazioni genetiche naturali tra le persone (che influenzano i livelli di certe proteine nel sangue) come una sorta di “esperimento naturale” per capire se avere livelli più alti o più bassi di una proteina causi un aumento o una diminuzione del rischio di una malattia, come l’ictus. Abbiamo usato dati genetici e proteici da grandi studi su popolazioni europee (INTERVAL e UK Biobank) e dati sul rischio di ictus dal consorzio MEGASTROKE.

I risultati della MR sono stati molto interessanti:

• Livelli più bassi di IL6R nel sangue sono risultati associati a un aumento del rischio di ictus ischemico. Questo suggerisce che una maggiore attività della via di segnalazione dell’IL-6 (indicata da meno recettori liberi nel sangue) sia dannosa.
• Anche livelli più bassi di CD44 e SMAD3 nel sangue sembrano essere associati a un aumento del rischio di ictus, suggerendo un possibile ruolo protettivo per queste proteine a livello sistemico o nella placca.

Questi risultati, ottenuti con un metodo completamente diverso, rafforzano l’importanza delle proteine che abbiamo identificato e suggeriscono che potrebbero non solo essere marcatori, ma anche avere un ruolo causale nella progressione della malattia e nel rischio di eventi clinici. Ovviamente, bisogna essere cauti, perché i livelli nel sangue potrebbero non riflettere perfettamente quelli nella placca.

Tiriamo le Somme: Cosa Abbiamo Imparato e Prospettive Future

Questo studio ci ha permesso di creare una sorta di “atlante” molecolare della progressione della placca aterosclerotica carotidea, combinando proteomica, immunoistochimica, transcrittomica a singola cellula e randomizzazione mendeliana. È un esempio di come l’integrazione di diverse tecnologie “-omiche” possa darci una visione molto più completa e profonda dei meccanismi di una malattia complessa.

Abbiamo identificato firme proteiche distinte per gli stadi avanzati della placca (IV, V, VI) e individuato proteine chiave (come IL6R, CD44, SMAD3, TREM2, GAL-1) che sembrano cruciali nel passaggio da placche stabili a instabili. Abbiamo visto dove si trovano queste proteine e in quali cellule agiscono, e abbiamo trovato indizi genetici che collegano alcune di esse al rischio di ictus.

Certo, ci sono delle limitazioni: lo studio è trasversale (non segue i pazienti nel tempo), la MR si basa su popolazioni europee, e c’è sempre una certa complessità nel correlare dati da tessuti diversi (placca vs sangue) e livelli diversi (mRNA vs proteina).

Tuttavia, credo che questo lavoro apra strade importanti. Le proteine identificate potrebbero diventare futuri biomarcatori per valutare il rischio di un paziente o bersagli terapeutici per sviluppare farmaci che stabilizzino le placche e prevengano infarti e ictus. È un passo avanti nella comprensione di questa malattia diffusa e pericolosa, e un esempio della potenza della ricerca multi-disciplinare. Il viaggio all’interno della placca continua!

Fonte: Springer