RC3H1: Abbiamo Smascherato un Difensore Nascosto Contro l’Influenza!

Ciao a tutti! Oggi voglio raccontarvi una storia affascinante che mescola biologia, virus e la potenza dei computer. Parliamo di influenza, quella fastidiosa malattia che ogni anno mette a letto tantissime persone. Ma non parleremo dei soliti sintomi o vaccini. No, scenderemo molto più in profondità, a livello molecolare, per scoprire come il virus dell’influenza A (IAV) cerca di fregarci e come, a volte, le nostre stesse cellule gli mettono i bastoni tra le ruote in modi inaspettati.

Il Nemico Invisibile: Come l’Influenza A Ci Inganna

Pensate al virus dell’influenza A come a un abilissimo scassinatore. Una volta entrato nelle nostre cellule respiratorie, non si limita a replicarsi e basta. No, è molto più subdolo: dirotta le nostre stesse “macchine” cellulari per i suoi scopi. Lo fa producendo delle proteine speciali, come la famigerata proteina non strutturale 1 (NS1), che agiscono come chiavi passe-partout per interagire con le proteine della cellula ospite (le nostre!).

La NS1 è una vera star nel mondo virale: è multifunzionale, aiuta il virus a eludere le nostre difese immunitarie, a bloccare la produzione delle nostre proteine, a favorire la sua replicazione e persino a determinare quanto sarà aggressiva l’infezione. Agisce sia nel citoplasma che nel nucleo della cellula, un vero agente doppio! Ad esempio, nel nucleo, interagisce con una proteina chiamata CPSF30, che è cruciale per la “maturazione” dei nostri RNA messaggeri. Bloccando CPSF30, NS1 manda in tilt la produzione delle nostre proteine. Astuto, vero?

La Caccia agli Alleati del Virus (o ai Nostri Difensori?) con i Computer

Capire esattamente con chi interagisce NS1 è fondamentale per sviluppare nuove strategie antivirali. Tradizionalmente, questo richiederebbe esperimenti lunghi e costosi in laboratorio. Ma oggi abbiamo un’arma in più: la bioinformatica!

Nel nostro lavoro, abbiamo messo a punto una sorta di “pipeline investigativa” computazionale in 3 fasi per scovare potenziali partner di NS1 tra le proteine umane. Le prime due fasi (che avevamo già sviluppato) ci avevano suggerito che NS1 potesse avere un debole per le proteine umane contenenti un particolare dominio chiamato “C3H zinc finger” (dito di zinco C3H). Pensate a questo dominio come a una specifica “presa” molecolare. La già citata CPSF30, guarda caso, ha proprio questi domini C3H!

Ma ci sono tante proteine con domini C3H nelle nostre cellule. Quali interagiscono davvero con NS1? Qui entra in gioco la terza fase, la novità del nostro approccio. Abbiamo usato uno strumento web super intelligente chiamato HVPPI (Human-Virus Protein-Protein Interaction predictor). Questo strumento usa algoritmi di intelligenza artificiale (come quelli che riconoscono le immagini o traducono testi) per analizzare le sequenze delle proteine (la loro “ricetta” di amminoacidi) e predire, con una certa probabilità, se due proteine – nel nostro caso, NS1 e una proteina umana C3H – interagiranno.

Abbiamo dato “in pasto” a HVPPI le sequenze di 35 proteine umane C3H (quelle corrispondenti a quelle identificate nei topi, dove spesso si studia l’influenza) insieme alla sequenza di NS1 del ceppo virale PR8 (un ceppo “classico” da laboratorio). Il computer ha “macinato” i dati e ci ha restituito una lista di 21 “sospetti” principali, classificati in base alla probabilità di interazione.

Dalla Teoria alla Pratica: L’Interrogatorio in Laboratorio

Avere una lista di sospetti è un conto, avere le prove è un altro! Per verificare se le previsioni del computer fossero corrette, abbiamo preso i 7 candidati con il punteggio più alto e li abbiamo messi alla prova nel mondo reale, in cellule umane coltivate in laboratorio (le linee cellulari 293FT e H1299).

Come abbiamo fatto? Abbiamo usato una tecnica chiamata co-immunoprecipitazione (co-IP). Immaginatela così: mettiamo nelle cellule sia la proteina NS1 (con un’etichetta “myc”) sia una delle proteine C3H candidate (con un’etichetta “flag”). Poi “peschiamo” la proteina C3H usando un’esca specifica per l’etichetta “flag”. Se NS1 si è legata alla proteina C3H, verrà “pescata” insieme a lei. Analizzando poi cosa abbiamo pescato, possiamo vedere se NS1 è presente.

I risultati sono stati entusiasmanti!

• Innanzitutto, abbiamo confermato l’interazione tra NS1 e CPSF30, il nostro “controllo positivo” noto. Ottimo, la tecnica funziona!
• Poi, abbiamo testato gli altri 6 candidati “top”. Ebbene, ben 4 di loro si sono rivelati capaci di legare NS1! Si tratta di MKRN1, RC3H1, ZC3H8 e ZC3H18. Nessuno aveva mai riportato prima che queste proteine interagissero con NS1 dell’influenza.
• Due candidati (PPP1R10 e ZC3H15), nonostante l’alto punteggio computazionale, non hanno mostrato interazione in questo esperimento. Questo ci ricorda che i computer sono potenti, ma non infallibili, e possono generare “falsi positivi”. La verifica sperimentale è sempre cruciale.

Comunque, un tasso di successo del 71.4% (5 su 7) è davvero notevole per una predizione computazionale! Significa che la nostra pipeline a 3 stadi è un ottimo punto di partenza per identificare interazioni reali.

Riflettori su RC3H1: Un Nuovo Protagonista Inatteso

Tra i nuovi partner di NS1, abbiamo deciso di concentrarci su uno in particolare: RC3H1 (conosciuta anche come Roquin-1). Perché lei? Beh, mentre ZC3H8 e ZC3H18 si trovano principalmente nel nucleo (come CPSF30), RC3H1 (e anche MKRN1) si trova sia nel citoplasma che nel nucleo. Questo suggeriva che potesse avere un ruolo diverso rispetto a CPSF30.

Abbiamo fatto altri esperimenti:

• Localizzazione: Abbiamo osservato al microscopio dove si trovavano NS1 e RC3H1 nelle cellule. Abbiamo visto che potevano trovarsi negli stessi compartimenti, suggerendo la possibilità di un’interazione diretta. Ancora più interessante: quando abbiamo infettato le cellule con il virus dell’influenza vero e proprio, abbiamo notato che una quota maggiore di RC3H1 si spostava dal citoplasma al nucleo! Il virus sembrava indurre un cambiamento nella sua posizione.
• Conferma in Infezione: Abbiamo ripetuto l’esperimento di co-IP, ma questa volta usando cellule infettate dal virus, non solo cellule in cui avevamo inserito le proteine artificialmente. E sì, anche in condizioni di infezione reale, NS1 “pescava” la RC3H1 endogena (quella naturalmente presente nella cellula). L’interazione era confermata!

La Domanda Cruciale: RC3H1 Aiuta o Ostacola il Virus?

Ok, RC3H1 interagisce con NS1 e cambia posizione durante l’infezione. Ma qual è il suo ruolo? Aiuta il virus a replicarsi (ruolo pro-virale) o lo ostacola (ruolo anti-virale)?

Per scoprirlo, abbiamo usato una tecnica chiamata “silenziamento genico” con siRNA. In pratica, abbiamo introdotto nelle cellule delle piccole molecole di RNA che impediscono specificamente la produzione della proteina RC3H1. Abbiamo creato due gruppi di cellule: uno con RC3H1 “silenziata” e uno di controllo (con un siRNA non specifico). Poi abbiamo infettato entrambi i gruppi con il virus dell’influenza PR8.

Dopo 15 ore, abbiamo misurato quanti nuovi virus erano stati prodotti dalle cellule. Il risultato è stato sorprendente: le cellule senza RC3H1 producevano significativamente più virus (circa 3 volte di più) rispetto alle cellule di controllo!

Questo significa che RC3H1 agisce come un fattore antivirale! In condizioni normali, la sua presenza ostacola la replicazione dell’influenza A. Quando la togliamo di mezzo, il virus ha vita più facile. È un po’ come se avessimo scoperto un difensore nascosto nelle nostre stesse cellule!

Questo è particolarmente interessante perché studi precedenti su un altro virus (il Citomegalovirus umano, HCMV) avevano mostrato l’opposto: lì, RC3H1 sembrava aiutare il virus. Questo dimostra come la stessa proteina ospite possa avere ruoli diversi a seconda del virus con cui interagisce.

Cosa Abbiamo Imparato e Dove Andiamo Ora?

Questa ricerca è un bell’esempio di come l’integrazione tra approcci computazionali e sperimentali possa accelerare la scoperta scientifica. La nostra pipeline a 3 stadi si è dimostrata efficace nell’identificare nuovi interagenti virali, anche se dobbiamo essere consapevoli dei possibili falsi positivi e continuare a migliorare gli algoritmi (magari integrando predizioni basate sulla struttura 3D delle proteine, come quelle fornite da AlphaFold2).

Abbiamo identificato RC3H1 come un nuovo fattore ospite con attività antivirale contro l’influenza A, probabilmente interferendo con qualche funzione della proteina NS1. L’effetto osservato (un aumento di 3 volte della replicazione virale dopo silenziamento) non è enorme, ma potrebbe essere sottostimato. Forse perché esiste una proteina “sorella”, RC3H2 (anch’essa predetta come interagente dalla nostra pipeline!), che potrebbe compensare parzialmente l’assenza di RC3H1. Sarà interessante indagare anche questo aspetto.

In futuro, vorremmo capire meglio il meccanismo esatto con cui RC3H1 ostacola il virus e verificare se questo ruolo antivirale si mantiene anche con altri ceppi di influenza.

Insomma, la battaglia tra virus e ospite è una partita a scacchi incredibilmente complessa che si gioca a livello molecolare. Grazie a strumenti sempre più potenti, stiamo iniziando a decifrare le mosse dei giocatori e, chissà, magari un giorno potremo usare queste conoscenze per dare scacco matto all’influenza!

Fonte: Springer