Geni Saltellanti Sotto la Lente: Come Abbiamo Svelato i Segreti degli Alu con un Test Parallelo di Massa!

Ciao a tutti! Oggi voglio raccontarvi una storia affascinante che arriva direttamente dal cuore del nostro DNA, una storia di “geni saltellanti” e di come siamo riusciti a spiarli come mai prima d’ora. Immaginate il nostro genoma come un gigantesco manuale di istruzioni, con miliardi di lettere. Bene, circa il 42% di questo manuale è composto da elementi che possono, in un certo senso, “copiarsi e incollarsi” da una pagina all’altra. Questi sono i retrotrasposoni.

Cosa Sono Questi Elementi Alu?

Tra questi “capitoli mobili”, una delle famiglie più numerose nei mammiferi, e quindi anche in noi umani, è quella degli elementi Alu. Pensate, derivano da un antichissimo RNA chiamato 7SL RNA. Gli Alu sono un po’ come dei passeggeri clandestini: per “saltare” da un punto all’altro del genoma, devono prendere in prestito gli strumenti (la “macchina di trasposizione”) da altri retrotrasposoni, come i famosi L1. Non sono autonomi, insomma.
Nel nostro genoma ci sono circa 1,1 milioni di copie di Alu! Possiamo dividerli in tre grandi sottofamiglie:

• AluJ: i più antichi, risalenti a circa 65 milioni di anni fa. Ormai sono piuttosto “degradati” e si pensa siano inattivi.
• AluS: più giovani, circa 30 milioni di anni. Alcuni di questi potrebbero essere ancora capaci di saltare.
• AluY: i più recenti, apparsi circa 25 milioni di anni fa. Alcuni elementi AluY sono considerati attivi nel genoma umano.

Si stima che nel genoma umano ci siano circa 852 elementi Alu funzionalmente intatti, con migliaia di altre copie che potrebbero diventare competenti per il salto. Pensate che si calcola una nuova inserzione di Alu nel genoma umano ogni 40 nascite! La loro attività di salto è legata alla lunghezza della loro “coda” di poliA e alla presenza di una sequenza centrale intatta di circa 280 paia di basi (bp). Studi precedenti avevano identificato 124 posizioni nucleotidiche conservate in tutti gli Alu attivi, ma nessuno aveva mai fatto uno studio funzionale esaustivo per correlare i cambiamenti di sequenza con l’attività di salto. Perché? Principalmente per la mancanza di test ad alta processività.

La Sfida: Studiare Migliaia di Varianti Contemporaneamente

Finora, per misurare l’attività di salto di un singolo elemento Alu, si usava un metodo che poteva testare un solo elemento alla volta. Immaginate quanto tempo ci vorrebbe per analizzare migliaia di varianti! Noi, invece, avevamo bisogno di qualcosa di più potente, qualcosa che ci permettesse di guardare a tantissime versioni di Alu contemporaneamente.
Ed è qui che entra in gioco la nostra idea: abbiamo sviluppato un “Massively Parallel Jumping Assay” (MPJA). In pratica, un test di salto massicciamente parallelo che ci permette di valutare la capacità di migliaia di elementi Alu di retrotrasporsi nelle cellule umane, tutti insieme!
Come abbiamo fatto? Abbiamo preso tre elementi Alu normalmente inattivi e uno attivo. Poi, usando una tecnica chiamata PCR “error-prone” (che introduce errori casuali), abbiamo generato una libreria pazzesca di 165.087 “aplotipi” (versioni) diversi di questi Alu. Li abbiamo quindi messi alla prova nelle cellule HeLa, un tipo di cellule umane spesso usate in laboratorio.

I Risultati: Una Mappa per la Retrotrasposizione

Ebbene, abbiamo trovato ben 66.821 aplotipi unici capaci di saltare! Questo ci ha permesso di individuare con precisione domini e varianti nucleotidiche cruciali per la trasposizione. È stato come accendere un faro su una mappa prima oscura.
Abbiamo osservato che anche un singolo cambiamento nucleotidico può essere sufficiente a modificare l’attività di un elemento Alu. Incredibile, vero? Una singola “lettera” sbagliata (o giusta, a seconda dei punti di vista) può risvegliare un gigante dormiente.
Mappando queste varianti sulla struttura secondaria dell’RNA dell’Alu (sì, perché l’Alu viene prima trascritto in RNA e poi questo RNA si “ripiega” in una forma specifica), abbiamo scoperto che certe caratteristiche a “stelo-ansa” (stem-loop) contribuiscono significativamente al potenziale di salto. Immaginate delle piccole forcine per capelli che aiutano l’RNA a fare il suo lavoro.

Come Funziona il Nostro MPJA nel Dettaglio?

Il nostro saggio si basa su un sistema ingegnoso. Il costrutto per la retrotrasposizione contiene l’Alu che vogliamo testare, guidato da un promotore specifico (7SL PolIII). All’estremità 3′ dell’Alu, abbiamo inserito una cassetta genica per la resistenza a un antibiotico (neomicina, Neo), orientata al contrario e preceduta da un segnale di terminazione.
Quando l’Alu viene trascritto dalla Polimerasi III, l’RNA risultante subisce uno splicing (un processo di “taglia e cuci”) grazie a un introne auto-catalitico. Questo RNA processato si lega poi al macchinario di trasposizione L1-ORF2 (che forniamo separatamente alle cellule) per integrarsi nel genoma.
La copia integrata perde alcune parti iniziali ma mantiene la cassetta Neo “tagliata” correttamente. Questo permette alla cellula di esprimere il gene della neomicina, diventando resistente all’antibiotico G-418. Quindi, solo le cellule in cui un Alu è “saltato” e si è integrato correttamente sopravvivono alla selezione con G-418!
Abbiamo prima standardizzato il tutto usando AluYa5, un elemento super attivo, come controllo positivo. Dopo aver trasfettato le cellule HeLa-HA (una linea cellulare permissiva per questo saggio) con il nostro AluYa5 e il macchinario L1-ORF2, e dopo circa 3 settimane di selezione con G-418, abbiamo visto formarsi delle belle colonie. Pochi falsi positivi, facilmente distinguibili.

Analisi delle Librerie Mutagenizzate

Una volta ottimizzato il saggio, ci siamo concentrati sulla famiglia AluS. Perché? Perché molti AluS hanno ancora la sequenza centrale di 280 bp intatta ma sono inattivi. Volevamo capire quali cambiamenti fossero necessari per riattivarli. Abbiamo scelto tre candidati AluS inattivi (AluS-6b, AluS-14b, AluS-h1.1) e, come controllo attivo, un AluSx.
Dopo aver generato le librerie mutagenizzate per ciascuno (chiamate AluSx-mut, Alu6b-mut, Alu14b-mut, e Aluh1.1-mut), le abbiamo sequenziate per vederne la complessità. Erano belle sature di varianti! In media, ogni sequenza Alu aveva circa 10 varianti, anche se c’era un certo “effetto fondatore” dovuto alla PCR.
Abbiamo quindi eseguito il test di retrotrasposizione con queste librerie. Dopo la selezione, abbiamo estratto il DNA genomico, amplificato specificamente gli Alu “saltati” e li abbiamo sequenziati. Confrontando le frequenze delle varianti nella libreria di partenza (plasmidica) con quelle trovate dopo il salto (genomica), abbiamo potuto calcolare un “punteggio di salto”.
Purtroppo, i dati per Aluh1.1 non erano molto consistenti tra le repliche, quindi l’abbiamo escluso dalle analisi successive. Ma per gli altri tre, i risultati erano solidi! Abbiamo identificato migliaia di aplotipi saltatori.

Quante Mutazioni Servono per Fare la Differenza?

Abbiamo scoperto che per Alu6b bastano almeno due cambiamenti nucleotidici e per Alu14b ne servono cinque per aumentare significativamente il potenziale di salto. Per AluSx, che è già attivo, è bastato un singolo cambiamento per incrementare ulteriormente la sua attività!
Interessante notare che anche frammenti di Alu più corti di 200bp, mancanti del “braccio destro”, sembravano capaci di saltare, confermando studi precedenti.
Analizzando le regioni, abbiamo visto che le mutazioni nei domini di legame per le particelle di riconoscimento del segnale (SRP9/14) avevano un impatto enorme. Queste particelle sono cruciali perché l’RNA dell’Alu si leghi al macchinario di trasposizione. Le varianti che miglioravano il salto erano significativamente arricchite in queste regioni SRP.

E Gli AluS nel Nostro Genoma?

Ci siamo chiesti: quanti degli AluS attualmente presenti nel genoma umano potrebbero riattivarsi? Nel genoma di riferimento ci sono circa mezzo milione di copie di AluS, e circa 852 hanno la sequenza centrale di 280bp intatta.
Confrontando i nostri aplotipi “saltatori” con questi AluS genomici, abbiamo visto che gli aplotipi mutagenizzati più vicini a un AluS genomico differivano per almeno sette nucleotidi (per Alu6B o AluSx) o dieci (per Alu14B). Se consideriamo solo gli “high jumpers” (quelli con altissima attività di salto), le distanze erano di otto e dodici nucleotidi rispettivamente.
Questo significa che alcuni elementi AluS attualmente “silenti” nel nostro genoma potrebbero diventare attivi se accumulassero tra le 8 e le 16 mutazioni. Considerando il tasso di mutazione germinale, non è un’ipotesi così remota nel corso dell’evoluzione!

Cosa Significa Tutto Questo?

Il nostro saggio MPJA è uno strumento potentissimo. Ci permette di:

• Testare migliaia di sequenze di retrotrasposoni in parallelo.
• Identificare domini chiave, strutture secondarie dell’RNA e singole varianti vitali per la retrotrasposizione.
• Capire meglio come i retrotrasposoni, come gli Alu, possono essere (ri)attivati.

Questa tecnologia potrebbe essere adattata per studiare altre famiglie di Alu (come gli AluY, ancora attivi), altri tipi di retrotrasposoni, e persino trasposoni a DNA. Potrebbe aiutarci a capire il ruolo di questi elementi nelle malattie umane, come il cancro, dove le mutazioni somatiche potrebbero riattivare elementi Alu e aumentare l’instabilità genomica.
Abbiamo scoperto che il numero di mutazioni necessarie per riattivare un AluS può essere inferiore a quanto si pensasse (fino a 7 mismatch invece dei 28 precedentemente stimati).
Certo, ci sono delle limitazioni. La PCR error-prone può avere dei bias. In futuro, librerie sintetiche di Alu potrebbero permettere un controllo ancora maggiore. Inoltre, il nostro saggio è ottimizzato per identificare ciò che promuove il salto, meno per ciò che lo inibisce, anche se abbiamo potuto identificare alcuni “non-saltatori”.

In conclusione, abbiamo fatto un bel passo avanti nella comprensione di questi affascinanti “geni saltellanti”. L’MPJA ci fornisce una piattaforma ad alta processività per studiare la loro attività en masse e per affrontare diverse questioni biologiche legate ai trasposoni. È come avere una nuova lente super potente per guardare dentro il dinamico mondo del nostro genoma!

Fonte: Springer