Ruxolitinib e il Paradosso di JAK2: Quando Inibire Significa Proteggere (e Potenziare!)

Ciao a tutti, appassionati di scienza e scoperte mediche! Oggi voglio parlarvi di qualcosa di veramente affascinante che sta succedendo nel mondo della ricerca sulla mielofibrosi (MF), una malattia del midollo osseo. Al centro della scena c’è un farmaco chiamato Ruxolitinib e una proteina chiave, la chinasi JAK2.

La Mielofibrosi e il Ruolo di JAK2

Partiamo dalle basi. Circa la metà dei casi di mielofibrosi è causata da una mutazione specifica nella proteina JAK2, la famosa JAK2-V617F. Questa mutazione rende la JAK2 “iperattiva”, un po’ come un interruttore bloccato su “ON”, portando a una produzione incontrollata di cellule del sangue e alla fibrosi del midollo osseo. Il Ruxolitinib è un farmaco approvato proprio per trattare la MF, ed è un inibitore di JAK1 e JAK2. In teoria, dovrebbe spegnere questo interruttore impazzito. E in effetti, clinicamente funziona: riduce le dimensioni della milza, migliora i sintomi. Fantastico, no? Beh, quasi.

Il Paradosso Inaspettato: Iperfosforilazione da Inibitore?

Qui le cose si fanno strane. Studiando cellule che esprimono JAK2-V617F trattate con Ruxolitinib, i ricercatori (e anche noi, nel nostro piccolo mondo di laboratorio!) si sono accorti di una cosa controintuitiva. Invece di vedere una *diminuzione* della fosforilazione di JAK2 (la fosforilazione in certi punti, come le tirosine Tyr1007/Tyr1008 nell’anello di attivazione, è un segno di attività), si osserva un *aumento* paradossale! Sì, avete capito bene: l’inibitore sembra rendere JAK2 *più* fosforilata in quei punti specifici, anche se poi blocca la sua azione a valle (ad esempio, la fosforilazione di STAT5 viene correttamente inibita).

Mi sono chiesto: ma come è possibile? È un effetto collaterale strano solo del Ruxolitinib? A quanto pare, no. Abbiamo testato altri inibitori di JAK2 simili (di “Tipo I”, che legano la forma attiva della chinasi), come fedratinib e lestaurtinib, e il risultato è lo stesso: iperfosforilazione paradossale. E non succede solo con la JAK2 mutata (V617F), ma anche con la JAK2 normale (wild-type, WT). Addirittura, un effetto simile si vede anche su altre chinasi della famiglia JAK, come JAK1 e TYK2, ma curiosamente non su JAK3. La struttura e il modo in cui l’anello di attivazione si piega sembrano diversi tra JAK2 e JAK3, e questo potrebbe essere un indizio.

Alla Ricerca della Spiegazione: Un Meccanismo Intrinseco

Allora, da dove viene questa fosforilazione extra? Abbiamo esplorato diverse ipotesi.

• Potrebbe essere colpa di un’altra chinasi a monte? No, usando una versione “morta” di JAK2 (kinase-dead, K882R) che non può fosforilare ma può ancora legare il farmaco, l’iperfosforilazione non avviene. Quindi, non è un attore esterno.
• Potrebbe essere che il Ruxolitinib faccia staccare le fosfatasi, cioè gli enzimi che normalmente rimuovono i gruppi fosfato? Abbiamo controllato se la fosfatasi SHP-2, nota per agire su JAK2, si staccasse in presenza di Ruxolitinib. Risultato: no, SHP-2 rimane legata a JAK2.
• È necessario che il farmaco si leghi attivamente alla chinasi? Sì! Abbiamo usato una variante di JAK2 resistente al Ruxolitinib (V617F + L983F). Con questa variante, il Ruxolitinib non riesce a legarsi bene e, guarda caso, non induce l’iperfosforilazione. Però, questa stessa variante è sensibile a fedratinib, e con fedratinib l’iperfosforilazione avviene eccome! Lo stesso vale per una variante resistente di JAK1.

Quindi, sembra proprio un meccanismo intrinseco: il legame dell’inibitore di Tipo I alla forma attiva di JAK2 è fondamentale per questo effetto paradossale.

La Rivelazione: Ruxolitinib fa da Scudo!

L’ipotesi che ha preso piede è stata questa: e se il Ruxolitinib, legandosi a JAK2, ne cambiasse la forma (la conformazione) in modo tale da “nascondere” l’anello di attivazione fosforilato, proteggendolo dall’azione delle fosfatasi? Immaginate le fosfatasi come delle forbicine molecolari che tagliano via i gruppi fosfato; se il Ruxolitinib blocca l’accesso a quei punti, i fosfati si accumulano.

Per testare questa idea, abbiamo fatto un esperimento di immunoprecipitazione “nativa”, cioè cercando di “pescare” la JAK2 fosforilata dalle cellule senza alterarne troppo la struttura. Ebbene, in presenza di Ruxolitinib o fedratinib, l’anticorpo specifico per la JAK2 fosforilata su Tyr1007/1008 non riusciva a legarsi e a pescarla, *nonostante sapessimo che era iperfosforilata*! Era come se il sito di legame dell’anticorpo fosse inaccessibile. Se invece l’esperimento veniva fatto in condizioni “denaturanti” (che distruggono la struttura tridimensionale della proteina), allora l’anticorpo riusciva a legarsi. Bingo! Questo suggerisce fortemente che l’anello di attivazione, in presenza dell’inibitore, si ripiega e si “nasconde” all’interno della proteina, diventando inaccessibile sia alle fosfatasi che al nostro anticorpo.

I Guardiani della Stabilità: Arg975 e Lys999

Ma cosa tiene l’anello di attivazione così ben nascosto? Studi strutturali precedenti e analisi comparative (ad esempio con la chinasi Akt, che mostra un fenomeno simile con alcuni inibitori) ci hanno messo sulla pista di due residui aminoacidici specifici nella JAK2: l’Arginina 975 (Arg975) e la Lisina 999 (Lys999). Questi residui sembrano formare delle interazioni chiave che stabilizzano l’anello di attivazione nella sua conformazione “protetta” quando è fosforilato e legato all’inibitore.

Abbiamo quindi creato delle versioni mutanti di JAK2-V617F in cui Arg975 o Lys999 erano sostituite con un’Alanina (R975A, K999A). Risultato? Queste mutanti mostravano una fosforilazione basale ridotta su Tyr1007/1008 (probabilmente perché l’anello è meno stabile e più esposto alle fosfatasi anche senza inibitore) e, cosa fondamentale, il trattamento con Ruxolitinib *non* causava più la forte iperfosforilazione paradossale vista nella JAK2-V617F normale! Questo conferma il ruolo cruciale di Arg975 e Lys999 nel meccanismo di protezione indotto dal farmaco.

L’Effetto Rebound: Cosa Succede Quando il Farmaco se ne Va?

Ok, abbiamo capito (più o meno) perché avviene l’iperfosforilazione. Ma che conseguenze ha? Ricordate, nonostante l’iperfosforilazione sull’anello, l’attività complessiva della chinasi è inibita dal Ruxolitinib. Ma cosa succede se il farmaco viene rimosso (come può accadere tra una dose e l’altra nel paziente, o se il trattamento viene interrotto)?

Abbiamo fatto esperimenti di “washout”: trattato le cellule con Ruxolitinib per un’ora, poi lavato via il farmaco e osservato cosa succedeva. La risposta è stata sorprendente: le cellule che erano state esposte al Ruxolitinib mostravano una riattivazione molto più forte della via di segnalazione a valle (in particolare di STAT5) rispetto alle cellule di controllo non pre-trattate. Non solo, questa iperattivazione portava a un aumento dell’espressione di geni bersaglio di STAT5, come c-Myc e, soprattutto, le PIM chinasi (PIM1 e PIM2), e addirittura a una maggiore proliferazione cellulare!

È come se la JAK2, tenuta “in carica” iperfosforilata ma inattiva dal Ruxolitinib, una volta libera dal farmaco, scatenasse una risposta più potente del normale. Un vero e proprio effetto “rebound”.

Implicazioni Cliniche: Persistenza, Resistenza e Nuove Strategie

Questo effetto rebound potrebbe avere implicazioni cliniche importanti. Potrebbe contribuire alla cosiddetta “persistenza” della malattia, cioè il fatto che il Ruxolitinib, pur migliorando i sintomi, spesso non elimina completamente il clone di cellule malate. Fluttuazioni nei livelli del farmaco potrebbero permettere questi picchi di iperattivazione intermittente, favorendo la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule tumorali.

Inoltre, l’aumento delle PIM chinasi è particolarmente interessante. Abbiamo visto che cellule rese resistenti al Ruxolitinib in laboratorio mostrano livelli più alti di PIM chinasi. E analisi di dati da pazienti con MF trattati con Ruxolitinib hanno mostrato livelli più alti di PIM2 e MPL (un altro gene potenzialmente coinvolto) rispetto a pazienti con altri trattamenti. Le PIM chinasi sono note per promuovere la crescita e la sopravvivenza cellulare. Se l’effetto rebound le potenzia, potrebbero giocare un ruolo nello sviluppo della resistenza al farmaco.

La buona notizia? Se le PIM chinasi sono un mediatore chiave di questo effetto rebound e della potenziale resistenza, allora bloccarle potrebbe essere una strategia vincente! Infatti, esperimenti in vitro hanno mostrato che combinare il Ruxolitinib con un inibitore delle PIM chinasi (come TP-3654) riduce drasticamente la capacità delle cellule di diventare resistenti al Ruxolitinib. Questo supporta fortemente l’idea di studi clinici che combinino inibitori di JAK e inibitori di PIM per i pazienti con MF, specialmente quelli che non rispondono più adeguatamente ai soli inibitori di JAK. Ci sono già studi in corso (come quello con TP-3654, NCT04176198) che esplorano questa strada.

Conclusioni e Prospettive Future

Quindi, il mistero del paradosso di Ruxolitinib sembra risolto: non è un’attivazione diretta, ma una protezione dalla defosforilazione dovuta a un cambiamento conformazionale indotto dal legame del farmaco, stabilizzato da residui chiave come Arg975 e Lys999. Questo meccanismo, però, porta a un pericoloso effetto rebound quando il farmaco viene rimosso, con iperattivazione di STAT5 e PIM chinasi.

Questa scoperta non solo ci aiuta a capire meglio come funzionano (e a volte falliscono) gli inibitori di JAK di Tipo I, ma apre anche nuove strade terapeutiche. La combinazione con inibitori di PIM sembra molto promettente. Inoltre, ci spinge a cercare inibitori di JAK di nuova generazione, magari di Tipo II o allosterici, che potrebbero non causare questo effetto paradossale e offrire benefici più duraturi.

La ricerca non si ferma mai, ed è affascinante vedere come lo studio approfondito di un fenomeno apparentemente strano possa portare a nuove intuizioni e potenziali terapie per malattie complesse come la mielofibrosi. Continuiamo a indagare!

Fonte: Springer