L’Orologio Segreto dello Zebrafish: Come Roraa Dirige la Danza tra Ritmo e Metabolismo!

Ciao a tutti, appassionati di scienza e curiosi della vita! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel mondo microscopico, ma con implicazioni enormi per la nostra salute: parleremo di orologi biologici, metabolismo e di un piccolo pesce che ci sta aiutando a svelare misteri incredibili. Pronti a tuffarvi? Ebbene sì, perché il protagonista di questa storia è lo zebrafish, un pesciolino tropicale che, credetemi, ha molto da insegnarci!

Tutti noi abbiamo un orologio interno, un meccanismo sofisticato che regola i nostri ritmi di sonno-veglia, la fame, e persino come il nostro corpo processa l’energia. Questi sono i famosi ritmi circadiani. Quando questo orologio si sballa, possono sorgere problemi metabolici non da poco. Ecco perché capire come funziona è fondamentale. Nel nostro laboratorio, ci siamo concentrati su un gene specifico, chiamato roraa, per vedere che ruolo gioca in questo intricato balletto biologico nello zebrafish.

Alla scoperta del ritmo di Roraa

Per prima cosa, volevamo capire se roraa avesse un suo “ritmo”. Utilizzando tecniche come la PCR quantitativa (un modo per misurare quanto un gene è “acceso”) e l’ibridazione in situ (che ci fa vedere dove il gene è attivo nel corpo del pesce), abbiamo confermato che sì, l’espressione di roraa segue un andamento ciclico, proprio come un orologio ben regolato! Ma come fa? Abbiamo scoperto che sul “promotore” di roraa (una specie di interruttore che ne controlla l’accensione) ci sono delle sequenze speciali, chiamate E-box, D-box e RORE, che sono come delle manopole regolate da altri geni dell’orologio biologico, come Bmal1 e Clock. Insomma, un vero e proprio lavoro di squadra!

Quando Roraa manca all’appello: i mutanti knockout

Per capire davvero cosa fa un gene, a volte la cosa migliore è… toglierlo di mezzo! Utilizzando la rivoluzionaria tecnica CRISPR/Cas9 (una sorta di forbice molecolare super precisa), abbiamo creato degli zebrafish “knockout” per roraa, cioè pesciolini in cui questo gene era stato reso inattivo. E cosa abbiamo osservato? Beh, un bel pasticcio, dal punto di vista circadiano!

I pesci senza roraa funzionante mostravano ritmi comportamentali alterati. Ad esempio, la loro attività di nuoto durante il giorno era significativamente ridotta rispetto ai loro fratelli “normali”. Non solo: anche l’espressione di altri geni chiave dell’orologio biologico, come bmal1b, clock1a, cry1aa e soprattutto per2, risultava diminuita. Era come se una delle rotelle principali dell’ingranaggio dell’orologio fosse venuta a mancare, scombussolando tutto il meccanismo.

Per darvi un’idea, l’attività di nuoto dei mutanti roraa−/− era più bassa, e anche se il ciclo di attività rimaneva sulle 24 ore in condizioni di buio costante, la fase era ritardata di circa 2 ore e l’ampiezza dell’attività era drasticamente ridotta, circa un terzo rispetto ai pesci normali. Immaginate di avere un orologio che segna sempre l’ora giusta, ma le cui lancette si muovono con meno vigore e un po’ in ritardo: ecco, qualcosa del genere!

Il legame diretto tra Roraa e Per2: una nuova chiave di lettura

Una delle scoperte più entusiasmanti è stata quella che riguarda il gene Per2 (Period 2). Abbiamo dimostrato che la proteina Roraa può regolare direttamente l’espressione di Per2. Come? Legandosi a una specifica sequenza sul promotore di Per2, chiamata elemento RORE (ROR response element). Pensatela come una chiave (Roraa) che si inserisce in una serratura specifica (RORE) per accendere o spegnere una luce (l’espressione di Per2).

Abbiamo fatto esperimenti in cellule coltivate in laboratorio: quando aumentavamo la quantità di Roraa, aumentava anche l’attività del promotore di Per2. E se toglievamo l’elemento RORE dal promotore di Per2? Puff! L’effetto di Roraa svaniva. Questa è una prova piuttosto forte di una regolazione diretta! Per confermare ulteriormente, abbiamo trattato le larve di zebrafish con sostanze che attivano (SR1078) o inibiscono (SR3335) RORα. I risultati? L’attivatore aumentava l’espressione di Per2, l’inibitore la diminuiva. Bingo!

Questo è importante perché aggiunge un nuovo tassello al complesso puzzle dei circuiti di feedback che mantengono il nostro orologio biologico sincronizzato sulle 24 ore. Mentre sapevamo che Rora è importante, questa sua capacità di influenzare direttamente Per2 tramite il RORE non era mai stata riportata prima, almeno non in questo contesto.

E se Roraa è “troppo” presente? Gli effetti della sovraespressione

Per avere un quadro completo, non ci siamo limitati a “spegnere” roraa. Abbiamo anche creato delle linee transgeniche di zebrafish che, sotto induzione termica (un piccolo shock di calore), producevano molta più proteina Roraa del normale. I risultati sono stati, come ci aspettavamo, opposti a quelli dei knockout. Questi pesci “super-Roraa” mostravano un’attività significativamente aumentata e una fase di attività anticipata. Anche l’espressione della maggior parte dei geni clock, incluso Per2, era aumentata. Questo conferma ulteriormente il ruolo cruciale di Roraa nel regolare sia il comportamento ritmico sia l’espressione dei geni dell’orologio.

Roraa, l’orologio e la dispensa: il collegamento con il metabolismo

Ma non è finita qui! Ricordate che avevamo parlato di un legame tra ritmi circadiani e metabolismo? Ebbene, analizzando l’intero “trascrittoma” (cioè l’insieme di tutti i geni attivi) nei nostri pesciolini knockout, abbiamo notato cambiamenti significativi in geni legati al metabolismo, specialmente quelli coinvolti nel metabolismo dei lipidi (i grassi).

In particolare, percorsi come il metabolismo degli acidi grassi e la via di segnalazione PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) erano alterati nei mutanti roraa−/−. Geni come cpt2 e fabp2, che sono attori chiave nella via PPAR e nel modo in cui il corpo gestisce i grassi, mostravano un’espressione ridotta. Cpt2, per esempio, è fondamentale per trasportare gli acidi grassi nei mitocondri, le centrali energetiche delle cellule, per essere “bruciati”. Fabp2, invece, aiuta a legare e trasportare gli acidi grassi. Una loro ridotta attività può scombussolare l’equilibrio lipidico.

Con esperimenti in vitro, abbiamo visto che Roraa può regolare direttamente l’espressione di questi geni metabolici, e nel caso di fabp2, questa regolazione avviene proprio attraverso un elemento RORE sul suo promotore. È come se Roraa non solo dirigesse l’orchestra dell’orologio biologico, ma avesse anche un ruolo diretto nel gestire le scorte energetiche della cellula!

Un modello per capire meglio

Quindi, cosa ci dice tutto questo? Immaginate una rete complessa: al centro ci sono i componenti principali dell’orologio (come Bmal1 e Clock). Questi attivano roraa. A sua volta, Roraa non solo partecipa ai circuiti di feedback dell’orologio regolando direttamente Per2, ma si estende anche a influenzare direttamente vie metaboliche cruciali, come quella del PPAR che gestisce i lipidi. È un sistema elegantemente interconnesso dove l’orologio e il metabolismo si parlano e si influenzano a vicenda, e Roraa sembra essere un messaggero chiave in questa conversazione.

Certo, lo zebrafish è un modello, e ci sono differenze con gli esseri umani. Inoltre, nello zebrafish esiste un altro gene simile, rorab, e studi futuri dovranno indagare il loro ruolo combinato. Tuttavia, molte di queste funzioni fondamentali sono conservate attraverso le specie. Ad esempio, anche nei topi la mancanza di Rora scombussola i ritmi e l’espressione dei geni clock in modo simile a quanto abbiamo visto nei nostri pesciolini.

Cosa portiamo a casa?

In sintesi, il nostro studio sullo zebrafish ha messo in luce il ruolo critico del gene Roraa nel regolare sia i ritmi circadiani sia i processi metabolici. Abbiamo scoperto che Roraa influenza direttamente l’espressione del gene Per2 attraverso l’elemento RORE, un dettaglio importante per capire come l’orologio biologico si auto-regola. Inoltre, l’assenza di Roraa altera il metabolismo dei lipidi e la via di segnalazione PPAR, sottolineando il suo impatto sull’omeostasi metabolica.

Queste scoperte non sono solo affascinanti dal punto di vista della biologia fondamentale, ma aprono anche nuove prospettive per comprendere e, speriamo un giorno, trattare disturbi metabolici legati all’alterazione dei ritmi circadiani, un problema sempre più comune nella nostra società moderna. E tutto questo, grazie anche a un piccolo, umile, ma incredibilmente utile pesciolino!

Fonte: Springer