Cuore di Zebrafish: Come i Cardiomiociti Invadono la Cicatrice con l’Aiuto dei Macrofagi!

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel mondo della rigenerazione cardiaca. Sapete, il nostro cuore, quello umano, ha una capacità molto limitata di ripararsi dopo un danno, come un infarto. Le cellule muscolari perdute, i cardiomiociti, vengono rimpiazzate da una cicatrice fibrosa che, sebbene utile all’inizio, a lungo andare compromette la funzione del cuore. Ma cosa succederebbe se potessimo insegnare al nostro cuore a rigenerarsi come fanno altri organismi?

Ecco che entra in gioco il mio piccolo eroe scientifico: il pesce zebra (Danio rerio). Questo pesciolino tropicale ha una capacità strabiliante: può rigenerare completamente il suo cuore dopo un danno, anche uno severo come quello indotto da crioinfortunio (congelamento di una parte del ventricolo), che mima abbastanza bene l’infarto umano creando una cicatrice ricca di collagene. Negli ultimi vent’anni abbiamo imparato tantissimo sui meccanismi alla base di questa rigenerazione, ma un aspetto mi ha sempre incuriosito particolarmente: come fanno i nuovi cardiomiociti a “invadere” e sostituire attivamente quella cicatrice densa di collagene? Non è mica facile farsi strada lì dentro!

Osservando da Vicino: Come i Cardiomiociti si Fanno Strada

Per capirlo, abbiamo deciso di guardare da vicino cosa succede proprio al confine tra il tessuto sano e la cicatrice, quella che chiamiamo la border zone. E quello che abbiamo visto è stato sorprendente! Tra i 7 e i 10 giorni dopo l’infortunio (dpci – days post cryoinjury), abbiamo osservato un picco di attività: i cardiomiociti al confine iniziavano a estendere delle specie di “dita” o “tentacoli”, che chiamiamo protrusioni, proprio dentro l’area danneggiata. Immaginate delle piccole cellule muscolari che cercano attivamente di farsi spazio.

Questi cardiomiociti “invasori” mostravano caratteristiche particolari:

• Avevano riattivato geni tipici dello sviluppo embrionale (un processo chiamato dedifferenziazione, come se tornassero un po’ indietro nel tempo per diventare più “mobili”).
• Mostravano segni di smantellamento delle loro strutture contrattili interne (i sarcomeri), soprattutto all’estremità della protrusione.
• Curiosamente, la maggior parte di queste cellule che protrudevano *non* si stava attivamente dividendo (proliferando) in quel preciso momento. Sembra che la proliferazione e la protrusione siano processi vicini ma distinti, forse la divisione avviene prima di “partire all’attacco”.

Grazie a tecniche di imaging dal vivo su fettine di cuore di zebrafish in rigenerazione (sì, possiamo tenerle vive e filmarle al microscopio!), abbiamo visto che queste protrusioni sono dinamiche, si estendono e si ritraggono, un po’ come delle antenne che esplorano l’ambiente circostante. Alcune cellule, specialmente quelle più superficiali (corticali), sembravano più “decise” nel loro movimento verso l’area danneggiata.

Non Sono Soli: Il Ruolo Chiave dei Macrofagi

Ma i cardiomiociti non fanno tutto da soli. Osservando queste zone di confine, abbiamo notato una presenza significativa di altre cellule: i macrofagi. Si tratta di cellule del sistema immunitario famose per “mangiare” detriti cellulari e regolare l’infiammazione. Ebbene, questi macrofagi erano lì, in stretta vicinanza con le protrusioni dei cardiomiociti. Anzi, a volte vedevamo proprio macrofagi che sembravano aver “assaggiato” pezzetti di membrana dei cardiomiociti!

Il picco di presenza dei macrofagi nella border zone coincideva proprio con il picco delle protrusioni dei cardiomiociti (7-10 dpci). E non erano macrofagi qualsiasi: sembravano appartenere a un sottotipo “pro-rigenerativo” o “anti-infiammatorio” (esprimevano marcatori come Cxcr4b e mrc1b), piuttosto che quelli puramente infiammatori che dominano le fasi iniziali della risposta al danno.

A questo punto, la domanda era d’obbligo: questi macrofagi sono solo spettatori o partecipano attivamente? Per scoprirlo, abbiamo usato dei modelli di zebrafish geneticamente modificati (i mutanti irf8) che hanno pochissimi macrofagi, oppure abbiamo eliminato i macrofagi usando dei farmaci specifici (clodronato liposomiale). I risultati sono stati chiari: senza macrofagi, i cardiomiociti formavano ancora protrusioni, ma queste erano significativamente più corte! Era come se mancasse loro la “spinta” per avanzare in profondità. Inoltre, abbiamo visto che senza macrofagi, il rimodellamento della matrice extracellulare (il “terreno” in cui le cellule si muovono), in particolare la degradazione del collagene proprio lì al confine, era quasi completamente assente. Sembra proprio che i macrofagi siano essenziali per “spianare la strada” ai cardiomiociti, digerendo un po’ la matrice per permettere loro di avanzare. Esperimenti specifici hanno anche suggerito che i macrofagi residenti nel cuore (quelli presenti già prima del danno) siano particolarmente importanti per questo processo.

Scavando a Livello Molecolare: Cosa Ci Dice l’RNA?

Per capire ancora meglio cosa succede a livello molecolare, abbiamo isolato le cellule proprio dalla border zone al picco dell’attività (7 dpci) e abbiamo analizzato l’espressione di tutti i loro geni usando una tecnica potentissima chiamata single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq). Questo ci ha permesso di vedere quali “istruzioni” (geni) fossero attive in ogni singola cellula.

Nei cardiomiociti della border zone (BZ CMs), rispetto a quelli più lontani dalla ferita (rCMs), abbiamo trovato attivi molti geni coinvolti in:

• Organizzazione del citoscheletro di actina (fondamentale per il movimento e la forma cellulare).
• Interazioni cellula-matrice extracellulare (come le cellule “sentono” e si “aggrappano” all’ambiente).
• Rimodellamento della matrice stessa (alcuni cardiomiociti sembrano produrre enzimi per modificare l’ambiente).
• Fattori di trascrizione della famiglia AP-1, che sapevamo già essere importanti per la risposta al danno e la protrusione.

Anche tra i macrofagi abbiamo identificato diversi sottotipi. Uno in particolare, che abbiamo chiamato “mac3 (ECM)”, era arricchito di geni legati proprio all’organizzazione e alla degradazione della matrice extracellulare, inclusi geni per enzimi come le metalloproteinasi (MMP). Questo confermava l’idea che una sottopopolazione di macrofagi fosse specializzata nel rimodellare l’ambiente per favorire la rigenerazione.

Mmp14b: La Chiave Molecolare per Sbloccare la Matrice?

Tra i geni interessanti emersi dalla nostra analisi, uno ha catturato la nostra attenzione: Mmp14b. Si tratta di una metalloproteinasi di matrice legata alla membrana cellulare, nota per la sua capacità di degradare diversi tipi di collagene e altre componenti della matrice, oltre ad attivare altre MMP. È spesso associata alla migrazione cellulare e all’invasività.

Abbiamo confermato che Mmp14b era effettivamente espressa nella border zone durante la rigenerazione e, cosa interessante, la trovavamo attiva in diversi tipi cellulari: nei cardiomiociti della zona di bordo, nei macrofagi (specialmente quelli del cluster mac3 ECM), nei fibroblasti (le cellule che producono la cicatrice) e nelle cellule endoteliali/endocardiche (che rivestono i vasi e le camere cardiache). Sembrava un giocatore chiave potenzialmente coinvolto da più fronti.

Quando Mmp14b Manca: Conseguenze sulla Rigenerazione

Se Mmp14b è così importante, cosa succede se la togliamo? Abbiamo generato dei pesci zebra mutanti in cui il gene mmp14b era stato eliminato (usando la tecnologia CRISPR/Cas9). Questi mutanti erano vitali e apparentemente normali, ma quando abbiamo indotto un crioinfortunio al loro cuore, abbiamo osservato dei problemi:

• Le protrusioni dei cardiomiociti erano significativamente più corte (molto simile a quanto visto senza macrofagi!).
• Il rimodellamento/degradazione del collagene specificamente nella border zone era ridotto.
• C’erano meno macrofagi presenti proprio in quella zona critica.
• A lungo termine (60 dpci), questi cuori mostravano una cicatrice di collagene persistente, segno di una rigenerazione incompleta.
• Interessantemente, anche l’espressione di alcuni marcatori dei fibroblasti “rigenerativi” (come col12a1a) risultava diminuita in questi mutanti.

Tutto questo senza influenzare la proliferazione dei cardiomiociti, confermando che Mmp14b sembra agire specificamente sulla capacità di invasione e sul microambiente della cicatrice, piuttosto che sulla divisione cellulare (almeno in questo modello di danno). Sembra quindi che Mmp14b sia cruciale non solo per l’azione diretta sulla matrice, ma anche per richiamare o mantenere i macrofagi nella zona giusta e forse per influenzare anche altri tipi cellulari come i fibroblasti.

Potenziare l’Invasione: Cosa Succede Sovraesprimendo Mmp14b?

E se facessimo il contrario? Se aumentassimo Mmp14b solo nei cardiomiociti? Abbiamo creato un altro modello di zebrafish transgenico in cui potevamo indurre la sovraespressione di mmp14b specificamente nei cardiomiociti dopo il danno. I risultati sono stati notevoli:

• Il numero e la lunghezza delle protrusioni dei cardiomiociti aumentavano significativamente!
• A 21 giorni, osservavamo una maggiore “copertura” della superficie apicale della ferita da parte dei cardiomiociti corticali, come se fossero riusciti a migrare più efficacemente sopra e dentro l’area danneggiata.

Questo suggerisce che aumentare l’attività di Mmp14b proprio nei cardiomiociti è sufficiente per potenziare la loro capacità invasiva. Ma c’è un’ultima svolta interessante: abbiamo provato a sovraesprimere Mmp14b nei cardiomiociti *e contemporaneamente* a eliminare i macrofagi. In questo caso, le protrusioni rimanevano comunque più lunghe (l’effetto di Mmp14b sulla protrusione sembra in parte indipendente dai macrofagi), ma la copertura finale della ferita da parte dei cardiomiociti corticali era di nuovo ridotta, tornando ai livelli di controllo. Questo ci dice che la storia è complessa: Mmp14b nei cardiomiociti aiuta l’invasione iniziale, ma per completare il processo, specialmente in certe zone del cuore come quella corticale, la presenza e l’azione dei macrofagi rimangono fondamentali.

Conclusioni e Prospettive Future

Quindi, cosa abbiamo imparato da questo tuffo nel cuore rigenerante del pesce zebra? Abbiamo scoperto che l’invasione della cicatrice da parte dei nuovi cardiomiociti è un processo attivo e complesso, una vera e propria “danza” cellulare. I cardiomiociti stessi si preparano attivando programmi genetici per muoversi e interagire con l’ambiente (in parte regolati da AP-1). Ma hanno bisogno di aiuto: i macrofagi, specialmente quelli residenti e con un fenotipo pro-rigenerativo, sono cruciali per rimodellare la matrice extracellulare al confine della ferita, creando un ambiente permissivo. Una molecola chiave in questo rimodellamento è Mmp14b, espressa da diverse cellule ma la cui funzione sembra essenziale per permettere l’avanzamento delle protrusioni cardiache, per mantenere i macrofagi al posto giusto e forse anche per regolare i fibroblasti rigenerativi.

Capire questi meccanismi nel pesce zebra è fondamentale perché ci offre potenziali bersagli terapeutici per il futuro. Immaginate se potessimo stimolare meccanismi simili nel cuore umano dopo un infarto: magari attivando Mmp14b in modo controllato, o fornendo il giusto tipo di macrofagi, o combinando queste strategie per rendere la cicatrice più “penetrabile” e favorire l’attecchimento e l’integrazione di nuove cellule cardiache, siano esse endogene o trapiantate. La strada è ancora lunga, ma studi come questo ci avvicinano un passo alla volta al sogno di poter riparare davvero un cuore spezzato.

Fonte: Springer