Il Blu Miracoloso della Spirulina: Come lo Purifichiamo con Astuzia (e Scienza!)

Ciao a tutti, appassionati di scienza e meraviglie naturali! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel mondo delle microalghe, e in particolare alla scoperta di un tesoro blu chiamato C-ficocianina. Avete presente quel blu intenso, quasi magico, che a volte vedete in certi integratori o coloranti alimentari naturali? Beh, molto probabilmente si tratta proprio di lei!

La C-ficocianina (CPC pe gli amici) è una proteina preziosissima estratta principalmente dalla Spirulina platensis, una microalga che è un vero e proprio concentrato di benessere. Questa molecola non è solo un bellissimo colorante naturale, ma vanta anche un sacco di proprietà benefiche: è un potente antiossidante, aiuta il sistema immunitario, ha effetti neuroprotettivi e anti-infiammatori. Insomma, un vero toccasana che trova applicazione nell’industria alimentare, cosmetica e farmaceutica. Pensate che viene usata persino come fotosensibilizzatore non tossico nella terapia fotodinamica dei tumori! Forte, no?

La Sfida: Ottenere un Blu Purissimo

Ok, la CPC è fantastica, ma c’è un “ma”. Estrarla e purificarla non è proprio una passeggiata. Per anni ci siamo affidati a metodi come la cromatografia a scambio ionico, l’ultrafiltrazione, la precipitazione con solfato d’ammonio… tecniche che, sebbene efficaci nel dare un prodotto puro, sono spesso costose, complesse e non sempre super efficienti in termini di resa. Immaginate di dover setacciare tonnellate di sabbia per trovare poche pepite d’oro: un lavoraccio! Inoltre, i classici sistemi di estrazione liquido-liquido che usano solventi organici sono un “no-go” per le proteine, perché rischiano di denaturarle, facendogli perdere tutte le loro fantastiche proprietà.

Ad esempio, alcuni ricercatori hanno provato con la lisi cellulare assistita da ultrasuoni, ma l’efficienza di estrazione della CPC era solo del 28%. Un po’ pochino, considerando quanto è preziosa!

La Svolta “Green”: i Sistemi Acquosi Bifasici (ATPS)

Ed è qui che entriamo in gioco noi, o meglio, la nostra ricerca di un metodo più intelligente, economico e amico dell’ambiente. Abbiamo puntato i riflettori sui sistemi acquosi bifasici (ATPS). Cosa sono? Immaginate di mescolare olio e aceto: non si mischiano, vero? Ecco, gli ATPS funzionano un po’ così, ma con ingredienti molto più sofisticati e, soprattutto, acquosi! Si tratta di un processo di estrazione liquido-liquido dove la stragrande maggioranza del sistema è acqua, e si formano due fasi acquose immiscibili tra loro. Il bello è che le biomolecole, come la nostra CPC, si distribuiscono in modo diverso tra queste due fasi, permettendoci di separarle.

I vantaggi degli ATPS? Sono ecologici, non tossici, permettono un’operazione continua, costano meno e sono facili da scalare per produzioni industriali. Una vera manna dal cielo!

I Nostri Ingredienti Speciali: Copolimeri Pluronic e Solventi Eutettici Profondi (DES)

Per il nostro ATPS “su misura” per la CPC, abbiamo deciso di usare una combinazione inedita e, a nostro avviso, vincente:

• Copolimeri a blocchi Pluronic: Si tratta di polimeri “intelligenti” (PEG-PPG). La loro particolarità? La loro idrofilia (quanto “amano” l’acqua) diminuisce con l’aumentare della temperatura. Questo significa che possiamo recuperarli facilmente semplicemente scaldando la soluzione!
• Solventi Eutettici Profondi (DES): Questi sono una vera figata! Sono miscele di accettori di legami idrogeno (HBA) e donatori di legami idrogeno (HBD) in specifici rapporti molari. Pensateli come dei “cocktail” molecolari. Sono economici, facili da sintetizzare, biodegradabili e poco tossici. Un’alternativa fantastica ai liquidi ionici (ILs), che, sebbene efficaci, possono essere costosi, difficili da purificare e talvolta tossici per l’ambiente.

Fino ad ora, nessuno aveva ancora provato a purificare la C-ficocianina usando un ATPS basato su questa accoppiata copolimero-DES. Eravamo pronti per la sfida!

Mettiamoci all’Opera: La Ricerca del Sistema Perfetto

Il primo passo è stato, ovviamente, estrarre la CPC grezza dalla Spirulina platensis. Abbiamo rotto le cellule algali con un metodo chimico (usando un buffer fosfato di sodio) e abbiamo raccolto l’estratto crudo, un mix di CPC, altre proteine, clorofilla e altri componenti cellulari.

Poi è iniziata la parte divertente: testare diversi ATPS. Abbiamo preparato una serie di DES basati su cloruro di colina (ChCl) come accettore, combinato con diversi donatori di legami idrogeno: fruttosio (ChCl-Fr), glucosio (ChCl-Glu), glicole etilenico (ChCl-EG) e glicerolo (ChCl-Gl). Come copolimeri, abbiamo usato due tipi di Pluronic: il Pluronic 10R5 (con una struttura PPG-PEG-PPG, che lo rende più idrofobico) e il Pluronic L35 (PEG-PPG-PEG, più idrofilo).

Abbiamo studiato attentamente come si formavano le due fasi (le cosiddette curve binodali) per ogni combinazione. È emerso che il tipo di DES non cambiava drasticamente la formazione delle fasi, probabilmente perché i donatori che abbiamo usato (glucosio, fruttosio, ecc.) sono tutti molto idrofili. La struttura del copolimero, invece, ha avuto un impatto maggiore: il Pluronic 10R5, essendo più idrofobico grazie alla sua struttura “inversa”, ha mostrato una tendenza migliore a separarsi in due fasi rispetto al L35.

La CPC Sceglie la sua “Casa”

Una volta definito il comportamento di fase, abbiamo aggiunto il nostro estratto grezzo di CPC ai vari sistemi ATPS (composti da 30% p/p di copolimero e 25% p/p di DES). La CPC è una biomolecola idrofila, quindi tende a preferire la fase più acquosa, che nel nostro caso era quella ricca di DES (la fase inferiore, più densa).

E i risultati? Il sistema composto da Pluronic 10R5 e ChCl-Glu (cloruro di colina-glucosio) si è rivelato il campione! Con questa combinazione, abbiamo ottenuto l’indice di purezza più alto per la CPC (2.3) e un’efficienza di estrazione dell’88%. Questo perché il glucosio, essendo molto idrofilo, ha aiutato a “tirare” la CPC nella fase inferiore, mentre il fruttosio, sebbene simile, sembrava trascinare con sé anche più contaminanti, riducendo la purezza.

Ottimizzazione: La Ricetta per il Successo

Trovato il sistema migliore (10R5/ChCl-Glu), non ci siamo fermati. Volevamo spremerlo al massimo! Abbiamo quindi ottimizzato diversi parametri:

• Concentrazione del DES (ChCl-Glu): Aumentando la concentrazione di ChCl-Glu fino al 35%, l’efficienza di estrazione è salita al 93%. Oltre, la viscosità della fase inferiore diventava troppo alta, ostacolando il passaggio della CPC.
• Concentrazione del Copolimero (Pluronic 10R5): Con una concentrazione fissa di DES al 35%, abbiamo variato quella del copolimero. L’efficienza massima (96%) e la purezza migliore (2.51) si sono avute con il 25% di Pluronic 10R5. Aumentando la concentrazione del copolimero, la sua fase diventava più idrofobica, “spingendo” più CPC verso la fase ricca di DES.
• Temperatura: Abbiamo testato temperature da 10 a 45 °C. Aumentando la temperatura, il copolimero diventa più idrofobico e la viscosità del DES diminuisce, facilitando il trasferimento della CPC. Il punto ottimale? 35 °C! A questa temperatura abbiamo raggiunto un’efficienza di estrazione stratosferica del 97% e un indice di purezza di 2.7. Temperature più alte, invece, rischiavano di degradare la nostra preziosa proteina.

Non si Butta Via Niente: Recupero del Copolimero e Ultrafiltrazione

Una delle cose più belle dei copolimeri Pluronic è la loro “intelligenza” termica. Scaldando la soluzione sopra i 57 °C (la sua temperatura critica inferiore di solubilità, o LCST), il Pluronic 10R5 diventa così idrofobico da separarsi dall’acqua, permettendoci di recuperarlo e riutilizzarlo! Abbiamo provato, e l’efficienza e la purezza sono rimaste praticamente invariate (2.8 di purezza e 97.6% di efficienza). Questo è un enorme vantaggio in termini di costi e sostenibilità!

Ma non eravamo ancora soddisfatti. Per ottenere una CPC ancora più pura, abbiamo preso la fase inferiore (ricca di DES e CPC) e l’abbiamo sottoposta a ultrafiltrazione con una membrana da 30 kDa. Risultato? Un indice di purezza finale di ben 4.8! Un blu spettacolare e super puro!

Infine, per essere sicuri della purezza, abbiamo fatto un’analisi chiamata SDS-PAGE. Questa tecnica ci permette di vedere le proteine separate in base al loro peso molecolare. Le corsie del gel hanno mostrato chiaramente come, partendo dall’estratto grezzo pieno di bande (contaminanti), siamo arrivati ad avere bande molto più pulite e definite per la CPC dopo l’ATPS e, soprattutto, dopo l’ultrafiltrazione, confermando la presenza delle sue subunità α (18 kDa) e β (21 kDa).

Un Futuro Blu Brillante

Quindi, cosa abbiamo imparato? Che combinando copolimeri Pluronic e solventi eutettici profondi in un sistema acquoso bifasico, possiamo estrarre e purificare la C-ficocianina dalla Spirulina in modo efficiente, economico e sostenibile. Abbiamo raggiunto un’efficienza del 97% e una purezza notevole, ulteriormente migliorabile con l’ultrafiltrazione, il tutto recuperando anche parte dei materiali!

Questo approccio apre nuove strade per la produzione su larga scala di questa fantastica molecola blu, rendendola più accessibile per tutte le sue preziose applicazioni. La scienza, a volte, sa essere davvero affascinante e… colorata! Spero che questo piccolo viaggio nel mondo della purificazione delle proteine vi sia piaciuto. Alla prossima!

Fonte: Springer