PTBP1: Il Regista Inaspettato nella Fabbrica degli RNA Circolari e il Suo Ruolo nella Leucemia

Ciao a tutti, appassionati di scienza e misteri cellulari! Oggi vi porto con me in un viaggio affascinante nel cuore delle nostre cellule, alla scoperta di molecole tanto enigmatiche quanto cruciali: gli RNA circolari, o circRNA. Immaginate un nastro che, invece di avere un inizio e una fine, si chiude su se stesso a formare un anello perfetto. Ecco, questi sono i circRNA, e fino a non molto tempo fa erano considerati quasi degli “errori di percorso” della cellula. Ma la scienza, si sa, è piena di sorprese!

Queste molecole, scoperte negli anni ’70 ma studiate a fondo solo di recente grazie alle meraviglie del sequenziamento dell’RNA e della bioinformatica, si formano attraverso un processo chiamato back-splicing. A differenza dei loro cugini lineari, gli mRNA, i circRNA sono incredibilmente stabili e si trovano principalmente nel citoplasma o negli esosomi. Hanno un sacco di funzioni interessanti, tra cui quella di agire come “spugne” per i microRNA (miRNA), impedendo a questi ultimi di silenziare altri geni. Insomma, dei veri e propri regolatori nell’ombra.

Ma come nascono questi anelli magici?

La biogenesi dei circRNA è un meccanismo complesso e non ancora del tutto chiarito. Sappiamo che ci sono almeno tre modi principali in cui possono formarsi. Uno coinvolge il classico macchinario di splicing, un altro sfrutta sequenze complementari invertite negli introni (le parti non codificanti del gene) che si appaiano, e un terzo modo, quello che ci interessa di più oggi, si affida a delle proteine chiamate RNA binding proteins (RBPs). Queste proteine sono come degli operai specializzati che aiutano l’RNA a piegarsi e a chiudersi nel modo giusto.

Alcune di queste RBPs, come QKI, Mbl, FUS, sono già note per il loro ruolo nella formazione dei circRNA. Ma la domanda che mi ronzava in testa era: ce ne sono altre, magari ancora più importanti, che ci sfuggono? E così, armato di curiosità e potenti strumenti di analisi trascrittomica, ho deciso di investigare.

La scoperta di PTBP1: un nuovo protagonista

Analizzando i profili dell’intero trascrittoma di ben 10 diverse linee cellulari, ho notato qualcosa di interessante. I “motivi”, cioè delle piccole sequenze specifiche a cui si legano le proteine, di una particolare RBP chiamata PTBP1 (Polypyrimidine Tract Binding Protein 1) erano particolarmente arricchiti nelle regioni fiancheggianti i circRNA, specialmente nelle cellule K562 (una linea cellulare derivata da leucemia mieloide cronica).

Questa è stata la prima scintilla! E se PTBP1 fosse un regolatore chiave della biogenesi dei circRNA? Per verificarlo, ho “spento” (tecnicamente si dice knockdown) il gene PTBP1 nelle cellule K562. Il risultato? Un calo drastico nell’espressione globale dei circRNA! Non solo, ma anche la proliferazione cellulare si è ridotta significativamente. Questo suggeriva che PTBP1 non solo aiutasse a creare i circRNA, ma che questi circRNA, a loro volta, fossero importanti per la crescita delle cellule.

Un aspetto cruciale era capire se PTBP1 influenzasse i circRNA agendo anche sulla produzione degli mRNA lineari derivanti dagli stessi geni. Sorprendentemente, le variazioni nell’espressione dei circRNA erano in gran parte indipendenti dalle variazioni trascrizionali lineari dei geni ospite. Questo significa che PTBP1 sembra avere un ruolo specifico nella “circolarizzazione” dell’RNA, piuttosto che nell’influenzare la produzione generale di RNA da quel gene.

Scavando più a fondo: il meccanismo d’azione

Per capire come PTBP1 esercitasse la sua magia, mi sono concentrato su un circRNA specifico, chiamato circSPPL3, la cui espressione era crollata dopo il knockdown di PTBP1. Ho costruito un “minigene reporter”, una sorta di circuito di prova genetico basato sul gene SPPL3. Questo mi ha permesso di vedere che PTBP1 si lega effettivamente agli introni che fiancheggiano la regione che diventerà circSPPL3. E la cosa ancora più interessante è che se mutavo i siti di legame per PTBP1, la formazione di circSPPL3 veniva ostacolata.

Ma la vera chicca è arrivata quando ho usato un altro sistema reporter, chiamato miniGFP. Questo sistema è geniale: divide il gene per la proteina fluorescente verde (GFP) in due parti, inserendole in ordine inverso. Solo se si forma un circRNA che ricongiunge correttamente le due parti, la cellula emette luce verde. Bene, ho inserito i siti di legame per PTBP1 (sequenze UYYY) sia a monte che a valle di questo costrutto. Risultato? Solo quando i siti di legame per PTBP1 erano presenti su entrambi i lati degli introni fiancheggianti, la produzione di circGFP (e quindi la fluorescenza) aumentava significativamente in presenza di PTBP1. Questo dimostra che PTBP1 ha bisogno di “ancorarsi” su entrambi i lati per promuovere efficacemente il back-splicing e la formazione del circRNA. Immaginatelo come un sarto che tiene insieme due lembi di stoffa prima di cucirli a cerchio!

PTBP1 e circRNA nella Leucemia Mieloide Acuta (LMA)

Tutto molto bello in laboratorio, ma cosa succede nel mondo reale, nelle malattie? Ho analizzato dati provenienti da campioni clinici di pazienti affetti da Leucemia Mieloide Acuta (LMA). E qui le cose si sono fatte ancora più serie. Sia PTBP1 che i livelli globali di circRNA erano significativamente più alti nei pazienti con LMA rispetto ai campioni sani. Non solo: i pazienti con LMA che avevano livelli più alti di PTBP1 mostravano tassi di sopravvivenza notevolmente inferiori. Un dato preoccupante che suggerisce un possibile contributo dell’aumento di espressione di PTBP1 alla progressione della LMA.

Anche il nostro amico circSPPL3 era sovraespresso nella LMA, seguendo lo stesso trend di PTBP1. Sembrava proprio che PTBP1 stesse orchestrando un aumento della produzione di circRNA anche in vivo, nel contesto di una malattia grave.

Per capire meglio il legame tra PTBP1, i circRNA e la LMA, ho costruito una rete ceRNA (competitive endogenous RNA). Ricordate le “spugne per miRNA”? Ecco, i ceRNA sono molecole (come i circRNA) che competono per legare gli stessi miRNA, influenzando così l’espressione dei geni bersaglio di quei miRNA. L’analisi di questa rete ha rivelato che i circRNA associati a PTBP1 partecipavano a processi biologici legati, guarda caso, alla proliferazione cellulare. Percorsi come la via di segnalazione MAPK, Ras e FoxO, tutti noti per essere coinvolti nella crescita cellulare, erano arricchiti.

Studi precedenti avevano già confermato che PTBP1 può promuovere la proliferazione delle cellule di LMA, ma i meccanismi sottostanti non erano chiari. Il mio studio suggerisce che PTBP1 potrebbe farlo proprio attraverso la modulazione dell’espressione di specifici circRNA “hub” (cioè centrali nella rete), come circFNDC3B, circABCC1, circRNF13, circPRKCB, circITPR2 e circAGTPBP1. Questi circRNA, a loro volta, potrebbero influenzare importanti miRNA come miR-1236-3p, miR-1248 e miR-3065-5p, creando un complesso scenario regolatorio che favorisce la crescita tumorale.

Cosa ci portiamo a casa?

Questo studio è il primo, a mia conoscenza, a identificare l’effetto regolatorio di PTBP1 sulla biogenesi globale dei circRNA. Abbiamo visto come questa proteina, legandosi agli introni fiancheggianti su entrambi i lati, sia cruciale per la formazione di queste molecole circolari. E, cosa ancora più importante, abbiamo iniziato a intravedere un possibile legame tra PTBP1, l’espressione dei circRNA e la progressione della leucemia mieloide acuta.

Certo, la strada è ancora lunga. Identificare i circRNA può essere complicato a causa della loro bassa espressione rispetto agli RNA lineari, e anche se abbiamo usato tecniche per arricchirli (come la digestione con RNase R che degrada gli RNA lineari ma non quelli circolari) e software multipli per ridurre i falsi positivi, metodi ancora più precisi come il sequenziamento di terza generazione potrebbero migliorare ulteriormente l’efficienza della validazione.

Inoltre, non tutti i motivi di legame per PTBP1 identificati computazionalmente sono poi confermati sperimentalmente con tecniche come il RIP-seq (RNA Immunoprecipitation sequencing). Questo ci dice che, sebbene il RIP-seq sia una guida essenziale, il suo ruolo nel predire i siti di legame cruciali per il back-splicing potrebbe essere limitato. È l’approccio combinato, con i minigeni e le mutazioni mirate, che ci ha dato le conferme più solide.

Le implicazioni future sono intriganti. Se PTBP1 e i circRNA ad esso associati giocano un ruolo così importante nella proliferazione cellulare nella leucemia, potrebbero rappresentare dei nuovi bersagli terapeutici? Potremmo, un giorno, pensare di inibire l’attività di PTBP1 o di specifici circRNA per contrastare la malattia? Sono domande aperte, che richiederanno ulteriori esperimenti “sul campo” (o meglio, “in provetta e in modelli animali”).

Per ora, abbiamo aggiunto una nuova, importante tessera al complesso puzzle della biologia dei circRNA e del cancro. E come sempre nella scienza, ogni risposta apre la porta a mille nuove domande. Ma è proprio questo il bello della ricerca, no?

Fonte: Springer