Una Proteina Nascosta nel RNA Circolare Blocca il Cancro al Fegato!

Ragazzi, oggi vi parlo di una scoperta che ha dell’incredibile, una di quelle che ti fanno dire “wow, la biologia è pazzesca!”. Siamo nel campo della lotta contro il cancro, in particolare contro il carcinoma epatocellulare (HCC), il tipo più comune di tumore al fegato. Sapete, questo brutto male è spesso legato alla cirrosi, una condizione in cui il fegato si riempie di cicatrici. Per anni abbiamo pensato al microambiente della cirrosi quasi solo come a un terreno fertile per il cancro, ma la realtà, come spesso accade nella scienza, è molto più sfumata.

Il Contesto: Cirrosi e Cancro, un Legame Complesso

L’HCC è un osso duro: alta incidenza, aggressività, tende a tornare… insomma, un problema serio per la salute pubblica. La cirrosi è un fattore di rischio enorme. Però, attenzione, non è tutto bianco o nero. Ricerche recenti, grazie a tecnologie super avanzate come il single-cell sequencing, ci stanno mostrando che anche nel microambiente cirrotico ci sono attori “buoni” e “cattivi”. Addirittura, alcune cellule (fibroblasti specifici) possono inibire lo sviluppo del tumore! E studi clinici hanno notato che i pazienti HCC con cirrosi a volte hanno meno metastasi precoci rispetto a quelli senza cirrosi. Strano, no? Sembra quasi che la cirrosi, in certi casi, possa mettere un freno. È in questo scenario complesso che entra in gioco il nostro protagonista.

Alla Scoperta di circCEP70: Un RNA Circolare Speciale

Avete mai sentito parlare degli RNA circolari (circRNA)? Non sono i soliti RNA lineari che conosciamo tutti. Questi sono delle molecole di RNA a singolo filamento chiuse a formare un anello, una specie di “cappio” molecolare. Sono super stabili e negli ultimi anni abbiamo scoperto che sono coinvolti in un sacco di processi, sia normali che patologici, inclusi i tumori.
Allora, cosa abbiamo fatto? Siamo andati a caccia di circRNA specifici nei tumori HCC che si sviluppano su fegato cirrotico, confrontandoli con quelli su fegato non cirrotico. E voilà! Abbiamo pescato un candidato molto interessante: circCEP70. Questo circRNA era espresso a livelli significativamente più alti nei campioni di HCC con background cirrotico. Ma la cosa ancora più intrigante è che, analizzando un gruppo più ampio di pazienti, abbiamo visto che alti livelli di circCEP70 nel tumore erano associati a una prognosi migliore! In pratica, chi ne aveva di più, tendeva a vivere più a lungo. Non solo, bassi livelli di circCEP70 si sono rivelati un fattore di rischio indipendente per una prognosi peggiore.

Identikit di circCEP70

Abbiamo studiato questo circCEP70 più da vicino. Deriva da un gene chiamato CEP70, situato sul cromosoma 3. È formato dalla “cucitura” di 4 pezzi del gene (esoni 3, 4, 5 e 6), per un totale di 522 basi. Abbiamo confermato la sua struttura circolare con vari esperimenti: è resistente a enzimi che degradano l’RNA lineare (RNase R) e stabile nel tempo (usando actinomicina D). E dove si trova nella cellula? Principalmente nel citoplasma, la “zuppa” cellulare fuori dal nucleo. Questo è importante, come vedremo tra poco.

Chi Controlla circCEP70? Spunta U2AF2

Ma perché circCEP70 è espresso in modo diverso? Spesso, dietro la regolazione dei circRNA ci sono delle proteine chiamate RNA-binding proteins (RBPs). Spulciando database e dati da altri studi (GEO dataset GSE62232), abbiamo trovato un sospettato principale: una proteina chiamata U2AF2. Questa U2AF2 sembra legarsi alle sequenze di RNA “fluttuanti” (introni) che vengono tagliate via quando si forma l’anello di circCEP70. E cosa fa? Sembra proprio che sopprima la produzione di circCEP70. Infatti, quando abbiamo ridotto U2AF2 nelle cellule, l’espressione di circCEP70 è aumentata, e viceversa. Nei campioni clinici, abbiamo trovato una correlazione inversa: più U2AF2 c’era, meno circCEP70 trovavamo. Quindi, U2AF2 agisce come un freno sulla produzione di questo circRNA potenzialmente benefico.

La Sorpresa: circCEP70 Non è Solo RNA, Codifica una Proteina!

E qui arriva il bello. Di solito pensiamo ai circRNA come a molecole non codificanti, che magari agiscono come “spugne” per altre molecole (microRNA) o legano proteine. Ma alcuni circRNA hanno la capacità nascosta di essere tradotti in proteine! Analizzando la sequenza di circCEP70, abbiamo trovato segnali che suggerivano potesse farlo: un sito di ingresso per i ribosomi (IRES) e una cornice di lettura aperta (ORF).
Abbiamo fatto la prova del nove: abbiamo preso cellule che producevano tanto circCEP70, estratto le proteine e usato la spettrometria di massa per analizzare quelle di una certa dimensione (attorno ai 18-19 kDa, la dimensione prevista). Bingo! Abbiamo trovato frammenti di una proteina che corrispondevano esattamente alla sequenza che ci aspettavamo venisse prodotta da circCEP70, inclusa una sequenza unica che attraversa proprio il punto di “cucitura” dell’anello! Abbiamo chiamato questa nuova proteina CEP70-160aa (perché lunga 160 amminoacidi).
Per essere sicurissimi, abbiamo creato degli anticorpi specifici per questa proteina e abbiamo confermato che veniva prodotta quando c’era circCEP70, ma non se mutavamo il suo segnale di inizio traduzione (il codone ATG). L’abbiamo trovata anche nei campioni clinici, e guarda caso, era meno abbondante nei tessuti tumorali rispetto a quelli sani adiacenti. Usando tecniche di imaging (immunofluorescenza) e predizioni strutturali avanzatissime (con AlphaFold 3, una figata pazzesca!), abbiamo visto che anche questa proteina se ne sta principalmente nel citoplasma.

L’Effetto Anti-Cancro di circCEP70/CEP70-160aa

Ok, abbiamo un circRNA che produce una proteina e sembra far bene ai pazienti. Ma cosa fa esattamente? Via con gli esperimenti!
In vitro (in laboratorio, su cellule):

• Abbiamo “spento” circCEP70 nelle cellule tumorali HCC: queste hanno iniziato a proliferare di più, a muoversi (migrare) e a invadere i tessuti circostanti molto più velocemente. Brutto segno.
• Abbiamo fatto il contrario, aumentando i livelli di circCEP70 (o direttamente della proteina CEP70-160aa): le cellule tumorali si sono calmate, proliferando meno e diventando meno invasive e mobili. Ottimo segno!

In vivo (su modelli animali):
Abbiamo iniettato cellule tumorali modificate in topi (modelli di tumore sottocutaneo, metastasi polmonari e metastasi intraepatiche). I risultati hanno confermato quanto visto in vitro:

• Senza circCEP70, i tumori crescevano di più e davano più metastasi.
• Con più circCEP70 (o CEP70-160aa), la crescita tumorale e le metastasi erano significativamente ridotte.

Quindi, è chiaro: circCEP70, attraverso la sua proteina CEP70-160aa, agisce come un soppressore tumorale, frenando la progressione dell’HCC.

Il Meccanismo: Come Fa CEP70-160aa a Fermare il Tumore?

Ma come fa questa proteina a mettere i bastoni tra le ruote al cancro? Dovevamo capirne il meccanismo d’azione.
Abbiamo usato una tecnica (Co-immunoprecipitazione, Co-IP) per “pescare” le proteine che si legano a CEP70-160aa nelle cellule. Abbiamo aggiunto un’etichetta (Flag tag) alla nostra proteina per facilitare la pesca. E chi abbiamo tirato su? Tra vari candidati, uno spiccava su tutti: PKM2 (Pyruvate Kinase M2).
PKM2 è un enzima super importante nel metabolismo delle cellule tumorali, ma fa anche altro. Può entrare nel nucleo della cellula e lì agire come un attivatore di altri segnali. Abbiamo confermato l’interazione tra CEP70-160aa e PKM2 con altri esperimenti e abbiamo persino usato AlphaFold 3 per predire esattamente come si legano a livello molecolare, identificando i punti di contatto cruciali.

Bloccare l’Ingresso al Nucleo

La cosa interessante è che sia CEP70-160aa che PKM2 si trovano principalmente nel citoplasma. Abbiamo ipotizzato: e se CEP70-160aa, legandosi a PKM2 nel citoplasma, gli impedisse di entrare nel nucleo?
Esperimenti di immunofluorescenza e frazionamento cellulare (separando nucleo e citoplasma) hanno confermato l’ipotesi! Quando c’era poco circCEP70 (e quindi poca proteina), molto più PKM2 finiva nel nucleo. Quando invece aumentavamo circCEP70 o la sua proteina, PKM2 restava “bloccato” fuori, nel citoplasma. Se mutavamo il circRNA in modo che non potesse più produrre la proteina, l’effetto svaniva. Quindi, CEP70-160aa agisce come un “buttafuori” per PKM2, non lo fa entrare nel sancta sanctorum della cellula, il nucleo.

L’Effetto a Cascata: Meno PKM2 nel Nucleo, Meno STAT3 Attivo

Perché è importante che PKM2 non entri nel nucleo? Perché una volta dentro, PKM2 può attivare (fosforilare) un’altra proteina chiave per la crescita e la metastasi tumorale: STAT3. STAT3 attivato (fosfo-STAT3 o p-STAT3) funziona come un interruttore che accende un sacco di geni pro-cancro.
Abbiamo controllato i livelli di STAT3 fosforilato nel nucleo. Risultato? Esattamente come previsto:

• Poco circCEP70 -> Più PKM2 nel nucleo -> Più STAT3 fosforilato.
• Tanto circCEP70/CEP70-160aa -> Meno PKM2 nel nucleo -> Meno STAT3 fosforilato.

Di conseguenza, anche l’espressione dei geni controllati da STAT3 (quelli coinvolti in proliferazione e metastasi come PH3, MMP2, MMP9, Vimentina) seguiva lo stesso andamento.

La Prova Finale: Bloccare PKM2 con un Farmaco

Per essere ancora più sicuri che fosse proprio il blocco della traslocazione nucleare di PKM2 il meccanismo chiave, abbiamo usato un farmaco sperimentale, Tepp-46, che fa esattamente questo: impedisce a PKM2 di entrare nel nucleo.
Abbiamo preso le cellule tumorali in cui avevamo spento circCEP70 (che quindi erano più aggressive) e le abbiamo trattate con Tepp-46. Risultato? Il farmaco ha bloccato l’ingresso di PKM2 nel nucleo, ridotto la fosforilazione di STAT3 e, soprattutto, ha invertito l’effetto pro-tumorale della mancanza di circCEP70! Le cellule trattate con Tepp-46 proliferavano e migravano meno, tornando quasi alla normalità. Lo stesso effetto lo abbiamo visto nei modelli animali: Tepp-46 ha ridotto la crescita tumorale e le metastasi anche nei topi con tumori “cattivi” per la mancanza di circCEP70.

Conclusioni: Una Nuova Speranza dalla Ricerca

Insomma, ragazzi, questa ricerca ci dice un sacco di cose nuove e importanti. Primo, che il microambiente della cirrosi è complesso e può anche ospitare meccanismi di difesa contro il cancro. Secondo, che i circRNA sono attori potentissimi, capaci persino di produrre proteine con funzioni biologiche cruciali.
Nello specifico, abbiamo scoperto che circCEP70, regolato negativamente da U2AF2, agisce come un soppressore tumorale nell’HCC su base cirrotica. Lo fa producendo la proteina CEP70-160aa, che sequestra PKM2 nel citoplasma, impedendogli di entrare nel nucleo e attivare la via di segnalazione pro-tumorale di STAT3.
Questa scoperta non solo ci aiuta a capire meglio come funziona l’HCC in un contesto di cirrosi, ma apre anche nuove strade. Potremmo pensare a terapie che aumentino i livelli di circCEP70 o della sua proteina, o che mimino la sua azione bloccando PKM2 nel citoplasma (un po’ come fa Tepp-46). C’è ancora tanto da studiare, ma è un passo avanti affascinante nella lotta contro questo tumore. La biologia non smette mai di sorprenderci!

Fonte: Springer