Parkinson: Scoperto il Meccanismo Principale di Diffusione dell’Alfa-Sinucleina nei Neuroni Umani

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di qualcosa che mi appassiona profondamente e che riguarda una delle malattie neurodegenerative più conosciute: il Parkinson. In particolare, voglio raccontarvi come, grazie a una tecnologia innovativa, siamo riusciti a fare un po’ di luce su un meccanismo fondamentale legato a questa patologia.

Il Mistero dell’Alfa-Sinucleina nel Parkinson

Al centro della scena c’è una proteina chiamata α-Sinucleina (αSyn). Normalmente, svolge il suo lavoro nel nostro sistema nervoso, ma nel Parkinson le cose vanno storte. Questa proteina inizia ad aggregarsi in forme anomale, formando quelli che chiamiamo corpi di Lewy e neuriti di Lewy, veri e propri “marchi di fabbrica” patologici della malattia. Pensate che il legame tra αSyn e Parkinson è stato scoperto nel lontano 1997!

Una delle cose più affascinanti e preoccupanti è che queste forme aggregate di αSyn sembrano comportarsi un po’ come dei “prioni”: non solo si accumulano, ma possono anche “viaggiare” lungo le connessioni neuronali (i neuriti) e indurre le proteine αSyn normali a ripiegarsi male, propagando così la patologia da un’area all’altra del cervello. Già il lavoro pionieristico di Heiko Braak aveva mostrato come la patologia da αSyn si diffondesse nel cervello dei pazienti seguendo uno schema abbastanza prevedibile, dal basso verso l’alto (caudo-rostrale).

Ma come avviene esattamente questa diffusione? È qui che le cose si complicano. Studi in vitro (in laboratorio) suggerivano meccanismi diversi, sia in avanti (anterogrado, dal corpo cellulare del neurone verso la sua terminazione) sia all’indietro (retrogrado, dalla terminazione verso il corpo cellulare), oltre al passaggio diretto da cellula a cellula. Studi più recenti in vivo (su organismi viventi) e analisi su tessuti umani, invece, sembravano puntare il dito principalmente sulla propagazione retrograda. Una discrepanza non da poco!

Una Piattaforma Innovativa per Studiare il Parkinson

Il problema principale è che i modelli in vitro usati finora, spesso basati su neuroni non umani o coltivati per brevi periodi, potrebbero non rappresentare fedelmente ciò che accade nel cervello umano, specialmente nei neuroni dopaminergici della substantia nigra, quelli più colpiti dal Parkinson. Inoltre, ricreare in laboratorio connessioni neuronali strettamente unidirezionali, come delle “autostrade a senso unico”, per studiare separatamente la propagazione anterograda e retrograda, è una sfida enorme, soprattutto per colture a lungo termine (parliamo di mesi!) necessarie affinché i neuroni derivati da cellule staminali umane (hiPSC) maturino a dovere.

Ecco dove entra in gioco il nostro lavoro. Abbiamo pensato: e se potessimo creare un modello in vitro più fedele, usando proprio neuroni dopaminergici umani derivati da cellule staminali di pazienti (in questo caso, da un paziente con una triplicazione del gene SNCA che codifica per l’αSyn, quindi più suscettibile alla patologia) e coltivarli su una piattaforma microfluidica progettata ad hoc?

Il nostro obiettivo era duplice:

• Sviluppare un dispositivo microfluidico super affidabile che garantisse connessioni assonali unidirezionali tra due popolazioni di neuroni separate, mantenendole vitali e funzionali per oltre 3 mesi.
• Usare questa piattaforma per studiare nel dettaglio come si diffonde l’αSyn patologica, distinguendo tra il trasporto delle “sementi” iniziali (le fibrille preformate, o PFFs, che usiamo per indurre la patologia) e la propagazione degli aggregati che si formano successivamente.

Dopo aver testato diversi design di microcanali, abbiamo trovato un vincitore: un pattern che abbiamo chiamato “fine leaves” (foglie sottili). Questo design si è dimostrato incredibilmente efficace nel bloccare la crescita degli assoni nella direzione “sbagliata”, raggiungendo un’efficienza del 99% nel mantenere la connessione unidirezionale per almeno 13 settimane, con una probabilità di fallimento bassissima (≤1%) fino a 20 settimane. Abbiamo anche verificato con esperimenti di live-imaging che gli assoni provenienti dalla camera “sbagliata” rimanevano intrappolati o tornavano indietro!

Inoltre, abbiamo messo a punto un sistema per mantenere le due camere fluidicamente isolate, usando una leggera differenza di pressione idrostatica, per essere sicuri al 100% che le PFFs aggiunte a una camera non potessero accidentalmente diffondere nell’altra.

L’Esperimento: Seguire le Tracce dell’Alfa-Sinucleina

Una volta messa a punto la piattaforma, siamo passati all’azione. Abbiamo coltivato i nostri neuroni dopaminergici umani (derivati dalla linea hiPSC AST18) nei dispositivi “fine leaves” per circa 70 giorni, finché non erano belli maturi. A quel punto, abbiamo introdotto le fibrille preformate di αSyn (PFFs) in una delle due camere (chiamiamole camera “Forward” per la direzione permessa e “Reverse” per quella bloccata) per dare il via al processo patologico. Queste PFFs funzionano come “semi” che inducono l’αSyn normale presente nei neuroni a ripiegarsi male e a diventare fosforilata (un’altra modifica tipica della malattia, specificamente sulla serina 129, che chiamiamo pSyn).

Abbiamo seguito l’evoluzione della patologia nel tempo, usando l’immunofluorescenza per visualizzare gli aggregati di pSyn. Abbiamo visto che ci volevano circa 30 giorni dopo l’aggiunta delle PFFs per iniziare a vedere livelli significativi di pSyn, che poi aumentavano in numero e dimensioni col passare delle settimane, formando strutture allungate lungo i neuriti e, in alcuni casi, aggregati più grandi che assomigliavano ai corpi di Lewy (positivi anche per altri marcatori come p62 e MAP2).

Ma la domanda cruciale era: come si spostavano queste PFFs e la patologia pSyn tra le due camere?

Per capirlo, abbiamo usato PFFs marcate con un colorante fluorescente (ATTO-568) e abbiamo seguito il loro movimento con la microscopia confocale time-lapse nelle prime 24 ore.

• Quando abbiamo aggiunto le PFFs-ATTO nella camera Reverse (studiando quindi il trasporto retrogrado verso la camera Forward): abbiamo osservato piccoli puntini fluorescenti muoversi lungo gli assoni attraverso i microcanali, in direzione retrograda, a una velocità media di circa 1.11 µm/s, in linea con dati precedenti. Alcuni di questi puntini sono stati visti uscire dai microcanali ed entrare nella camera Forward.
• Quando abbiamo aggiunto le PFFs-ATTO nella camera Forward (studiando il trasporto anterogrado verso la camera Reverse): non abbiamo osservato alcun puntino muoversi attraverso i microcanali nelle prime 24 ore. L’unico, raro, esempio di movimento anterogrado è stato visto dopo 5 giorni, ma senza che i puntini raggiungessero la camera Reverse.

Questo primo risultato suggeriva fortemente che il trasporto iniziale delle “sementi” PFFs fosse prevalentemente retrogrado.

La Sorpresa: Un Viaggio Prevalentemente ‘Contromano’

E la patologia pSyn che si sviluppava nel tempo? Abbiamo lasciato che la patologia si sviluppasse per diverse settimane (fino a quasi 3 mesi) dopo l’aggiunta delle PFFs (non marcate questa volta) e poi abbiamo quantificato i livelli di pSyn nelle due camere.

I risultati sono stati chiarissimi e hanno confermato l’importanza della via retrograda:

• PFFs aggiunte nella camera Forward (propagazione anterograda): Abbiamo visto un aumento significativo della patologia pSyn nella camera Forward nel tempo. Nella camera Reverse (non seminata), i livelli di pSyn erano molto, molto più bassi, anche se significativamente superiori ai controlli (senza PFFs), suggerendo che un po’ di propagazione anterograda avveniva, ma era lenta e poco efficiente. La patologia nella camera Reverse si trovava principalmente vicino ai microcanali e non aumentava significativamente nel tempo lontano da essi.
• PFFs aggiunte nella camera Reverse (propagazione retrograda): Qui la musica cambiava radicalmente. Non solo la camera Reverse (seminata) mostrava patologia, ma anche la camera Forward (non seminata) presentava livelli di pSyn relativamente alti e diffusi, anche a più di 1 mm di distanza dai microcanali!

Quantificando l’efficienza, abbiamo calcolato che la propagazione retrograda era circa 4.5 volte più efficiente di quella anterograda nelle nostre condizioni sperimentali (considerando tempi di incubazione sotto le 8 settimane). Questo risultato è perfettamente in linea con quanto osservato negli studi in vivo più recenti!

Trasporto Lungo l’Assone o Passaggio da Neurone a Neurone?

Ok, la propagazione anterograda è meno efficiente, ma avviene. La patologia che vediamo nella camera Reverse (quando le PFFs sono aggiunte nella Forward) è dovuta solo al trasporto all’interno degli assoni che provengono dalla camera Forward, o c’è anche un passaggio della patologia da questi assoni ai neuroni “residenti” nella camera Reverse?

Per distinguerlo, abbiamo usato un trucchetto: poco prima di analizzare le colture, abbiamo aggiunto un colorante fluorescente (CFSE) solo nella camera Forward. Questo colorante entra nei neuroni e si diffonde lungo i loro assoni, permettendoci di identificare nella camera Reverse quali neuriti provenivano dalla camera Forward (CFSE-positivi) e quali appartenevano ai neuroni originariamente piastrati lì (CFSE-negativi).

Analizzando la co-localizzazione della patologia pSyn con il segnale CFSE, abbiamo scoperto che la maggior parte della patologia pSyn nella camera Reverse si trovava su neuriti CFSE-positivi (cioè, era stata trasportata lungo gli assoni provenienti dalla camera Forward). Tuttavia, abbiamo anche trovato livelli bassi, ma statisticamente significativi rispetto ai controlli, di patologia pSyn su neuriti CFSE-negativi. Questo suggerisce che un certo livello di trasferimento da cellula a cellula in direzione anterograda avviene, ma è un fenomeno decisamente minoritario rispetto al trasporto intracellulare lungo gli assoni e, soprattutto, rispetto all’efficienza della propagazione retrograda generale.

Cosa Significa Questa Scoperta?

Per la prima volta, usando un modello in vitro avanzato basato su neuroni umani rilevanti per la malattia e coltivati a lungo termine in condizioni controllate, siamo riusciti a dimostrare in modo robusto che la propagazione retrograda è il meccanismo dominante per la diffusione dell’α-Sinucleina patologica, almeno nelle fasi iniziali che il nostro sistema modella. Questo risultato riconcilia le osservazioni fatte in vivo con quelle in vitro e suggerisce che la nostra piattaforma è uno strumento potente e fisiologicamente più rilevante per studiare i meccanismi del Parkinson.

Non stiamo dicendo che la propagazione anterograda o il trasferimento cellula-cellula non esistano o non siano importanti in fasi diverse della malattia, ma i nostri dati indicano chiaramente qual è la via preferenziale per l’inizio della diffusione.

Uno Sguardo al Futuro

Questa piattaforma apre scenari molto interessanti. Possiamo usarla per testare farmaci o terapie mirate a bloccare specificamente la propagazione retrograda dell’αSyn. Inoltre, potremmo rendere il modello ancora più complesso aggiungendo altri tipi di cellule presenti nel cervello, come astrociti o microglia, per vedere come influenzano la diffusione della patologia.

Insomma, abbiamo fatto un passo avanti importante nella comprensione di come il Parkinson si diffonde nel cervello. È come aver scoperto la direzione principale di un’autostrada usata dalla malattia. Ora, possiamo concentrarci meglio su come mettere dei blocchi stradali efficaci! È un lavoro lungo, ma ogni scoperta ci avvicina un po’ di più all’obiettivo.

Fonte: Springer