Proteine Danzanti: La Nuova Magia per Scoprire Farmaci Super Mirati!

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di una cosa che mi sta davvero entusiasmando nel mondo della ricerca farmacologica. Immaginate di poter “spiare” le proteine, le operaie instancabili del nostro corpo, mentre interagiscono con potenziali farmaci. Non sarebbe fantastico? Beh, tenetevi forte, perché sembra proprio che abbiamo trovato un modo ingegnoso per farlo, e potrebbe rivoluzionare come scopriamo nuove medicine!

Il Problema: Trovare il Farmaco Giusto è un Labirinto

Da sempre, uno dei grattacapi più grossi per noi scienziati è capire esattamente come un farmaco “parla” con la sua proteina bersaglio. Le tecniche tradizionali spesso sono complicate, costose, o non abbastanza sensibili, specialmente quando si tratta di analizzare migliaia di composti in fretta (quello che chiamiamo High-Throughput Screening, o HTS). A volte, è come cercare un ago in un pagliaio con gli occhi bendati!

L’Idea Geniale: Far “Cantare” le Proteine con la Luce!

E se vi dicessi che abbiamo escogitato un sistema dove le proteine ci dicono da sole se un farmaco le ha “toccate” nel modo giusto? L’idea si basa su un fenomeno affascinante: quando una molecola (un ligando, che potrebbe essere un futuro farmaco) si lega a una proteina, questa cambia leggermente la sua forma, la sua “danza” molecolare. Noi abbiamo pensato: e se potessimo “vedere” questo cambiamento?

Qui entra in gioco una star della bioluminescenza: la NanoLuciferasi (NLuc). È un enzima che produce luce, un po’ come fanno le lucciole. L’intuizione è stata quella di “attaccare” questa NLuc, o un suo piccolo frammento attivo chiamato HiBiT, a un’estremità della nostra proteina bersaglio. Quando il ligando si lega alla proteina, il cambiamento strutturale si trasmette fino alla NLuc (o al frammento HiBiT che si ricombina con la sua parte mancante, LgBiT), modificando la quantità di luce emessa. Geniale, no? Abbiamo chiamato questa piattaforma SDR (Structural Dynamics Response) assay.

Il bello è che è un saggio non competitivo (non dobbiamo usare sonde marcate che competono col farmaco), indipendente dalla funzione della proteina (non ci serve che l’enzima faccia il suo lavoro per vedere se il farmaco si lega), quantitativo, isotermico (tutto a temperatura ambiente) e, udite udite, ci dà un aumento di segnale! Spesso, nei test, cerchiamo una diminuzione; qui, più luce significa che qualcosa di interessante sta accadendo.

La Prova del Nove: La Lucciola e i Suoi Segreti

Per testare la nostra idea, abbiamo iniziato con un classico: la luciferasi di lucciola (FLuc), un enzima ben studiato. Le abbiamo fuso la NLuc o il tag HiBiT. Poi, abbiamo usato un noto inibitore della FLuc, il PTC124. Ebbene, non solo abbiamo visto che il PTC124 inibiva l’attività della FLuc (come ci aspettavamo), ma il nostro sistema SDR ha “sentito” il legame attraverso un aumento della luminescenza della NLuc! Ancora più interessante, abbiamo potuto distinguere il legame del PTC124 in presenza o assenza di ATP (il “carburante” della FLuc), rivelando affinità diverse. Questo ci ha fatto capire che potevamo “vedere” sfumature farmacologiche complesse.

Abbiamo poi scatenato il sistema su una libreria di oltre 1300 composti noti per interagire con la FLuc. I risultati sono stati spettacolari: il saggio SDR non solo ha identificato gli inibitori, ma ha anche rivelato come alcuni composti avessero bisogno dell’ATP per legarsi meglio, mentre altri se ne fregavano. Abbiamo persino colto indizi su siti di legame allosterici, cioè punti sulla proteina diversi dal sito attivo principale, che sono bersagli super interessanti per nuovi farmaci.

Questo primo successo ci ha dato la carica per esplorare oltre.

Un Jolly per Tante Proteine Diverse: Dalle Chinasi al DNA

La vera domanda era: funzionerà anche con altre proteine, magari completamente diverse dalla FLuc? Abbiamo preso il coraggio a due mani e abbiamo provato con un bel po’ di famiglie proteiche:

• Chinasi (ABL1 e PKA): Questi sono enzimi cruciali in molte malattie, incluso il cancro. Abbiamo fuso HiBiT alla chinasi ABL1 e alla PKA. Risultato? Abbiamo rilevato il legame di inibitori noti come l’imatinib e persino di molecole che si legano a siti allosterici, come l’asciminib, cosa che i test funzionali classici a volte faticano a fare. E spesso, il nostro saggio SDR era più sensibile!
• Isomerasi (iPGM): Abbiamo studiato l’iPGM, un enzima presente in parassiti e considerato un bersaglio farmacologico. I test tradizionali per l’iPGM sono un incubo, richiedono un sistema accoppiato con altri due enzimi. Con il nostro approccio SDR, è stato tutto più semplice e diretto. Siamo riusciti a misurare il legame di peptidi inibitori a concentrazioni bassissime, nell’ordine dei picomolari (miliardesimi di millimolare!). Abbiamo anche distinto l’affinità per enzimi simili ma di specie diverse (ortologhi).
• Ligasi del DNA (da E. coli e fago T7): Queste proteine riparano il DNA. Anche qui, sorpresa! Il saggio SDR ha rilevato il legame sia del DNA stesso sia dei loro cofattori (NAD+ per E. coli, ATP per T7). È stato interessante notare come la posizione del tag HiBiT (all’inizio o alla fine della proteina) potesse influenzare il segnale, dándoci indizi sulla “comunicazione” interna della proteina.
• Reduttasi (DHFR): La diidrofolato reduttasi (DHFR) è un bersaglio per farmaci antitumorali come il metotrexato. Il test classico per la DHFR ha i suoi limiti. Con l’SDR, abbiamo misurato il legame del metotrexato e di altri antifolati con una sensibilità pazzesca, circa 100 volte maggiore del test standard!

La Vera Magia: Direttamente dalle Cellule!

Forse la cosa più sbalorditiva è che siamo riusciti a far funzionare il saggio SDR usando proteine direttamente da lisati cellulari, cioè dal “brodo” che si ottiene rompendo le cellule, senza bisogno di purificare la proteina bersaglio! Abbiamo usato la tecnica CRISPR/Cas9 per modificare geneticamente delle cellule umane (HEK293) in modo che la loro DHFR endogena avesse il tag HiBiT. Poi abbiamo semplicemente lisato le cellule e fatto il test. Ebbene, abbiamo replicato i risultati ottenuti con la proteina purificata, distinguendo il legame degli antifolati in presenza o assenza del cofattore NADPH. Questo è rivoluzionario, perché ci permette di studiare le proteine nel loro ambiente naturale, con tutte le loro modifiche e i loro partner, cosa che spesso si perde con le proteine purificate.

Ma Come Funziona Esattamente Questa “Magia”?

Non abbiamo ancora svelato tutti i dettagli del meccanismo, ma l’ipotesi è che il legame del ligando induca sottili riarrangiamenti strutturali o uno “smorzamento” delle vibrazioni naturali della proteina. Questi cambiamenti si propagano come un’onda attraverso la struttura proteica fino al sensore NLuc/HiBiT, influenzandone l’attività catalitica e quindi l’emissione di luce. Abbiamo visto esempi cristallografici dove il C-terminale di una proteina (iPGM) passa da disordinato a una bella alfa-elica dopo il legame del ligando, o dove le estremità N- e C-terminale di una ligasi si avvicinano di ben 62 Ångström! Questi sono cambiamenti importanti che il nostro sensore può “percepire”.

Perché Questo è un Punto di Svolta?

Questa piattaforma SDR ha un potenziale enorme. Pensateci:

• È semplice: un formato “mescola e leggi”, senza passaggi di separazione complicati.
• È versatile: funziona con tantissime proteine diverse.
• È sensibile: possiamo rilevare legami anche a concentrazioni bassissime di proteina.
• È scalabile: perfetto per l’HTS su piastre da 384 o 1536 pozzetti.
• Apre le porte a bersagli “difficili”: proteine che erano troppo costose o complesse da studiare con i metodi attuali, o per le quali non esisteva un buon saggio.
• Permette di studiare proteine endogene direttamente da lisati cellulari.

Insomma, potremmo essere in grado di accelerare la scoperta di nuovi farmaci, incluse quelle molecole innovative come le “colle molecolari” (molecular glues) o gli agenti bifunzionali, per bersagli che prima erano considerati intrattabili.

È un momento davvero eccitante per essere in questo campo, e non vedo l’ora di vedere quali nuove scoperte ci riserverà questa “danza” delle proteine!

Fonte: Springer