Flebotomi e Virus Nascosti: La Nostra Caccia High-Tech nel Cuore del Mediterraneo!

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un’avventura scientifica davvero affascinante, un po’ come una caccia al tesoro, ma al posto dell’oro cercavamo… virus! E non virus qualsiasi, ma quelli trasmessi dai flebotomi, o pappataci, quelle minuscole creature che possono ronzarci intorno nelle sere d’estate mediterranee. Parliamo dei phlebovirus trasmessi da flebotomi (SbPV), una famiglia di virus diffusa in tutto il mondo che, diciamocelo, rappresenta una potenziale minaccia per la nostra salute.

Negli ultimi decenni, abbiamo iniziato a individuarli sempre più spesso, ma la verità è che sappiamo ancora troppo poco sulla loro ecologia, sulle loro caratteristiche precise e, soprattutto, su quanto possano essere clinicamente rilevanti. Immaginate quanti casi di infezione da SbPV potrebbero passare inosservati o essere scambiati per una banale influenza, semplicemente perché c’è poca consapevolezza e mancano metodi di screening standardizzati.

L’Iniziativa CLIMOS e la Necessità di Standardizzazione

È qui che entriamo in gioco noi, o meglio, il progetto europeo CLIMOS (EU Climate Monitoring and Decision Support Framework for Sand Fly-borne Diseases Detection and Mitigation). L’obiettivo di CLIMOS è ambizioso: capire come i cambiamenti climatici e i fattori ambientali influenzino la vita dei flebotomi e la diffusione delle malattie che trasportano. Per fare questo, però, avevamo bisogno di dati confrontabili, solidi. E come si ottengono dati confrontabili quando diversi laboratori usano magari metodi leggermente diversi? Con una Valutazione Esterna di Qualità (EQA)!

Così, ci siamo rimboccati le maniche e abbiamo organizzato questa EQA. L’idea era semplice ma cruciale: standardizzare il rilevamento molecolare dei phlebovirus. Perché? Per poter “nutrire” i modelli matematici con dati affidabili e capire l’impatto del clima sulla dinamica e diversità dei flebotomi e dei microrganismi che portano con sé. Nove laboratori da sette Paesi diversi (Austria, Francia, Italia, Portogallo, Spagna, Turchia e Israele) hanno accettato la sfida. Una bella squadra internazionale!

La Sfida: Kit, Campioni e un Protocollo Comune

Cosa abbiamo fatto, in pratica? Abbiamo spedito a ciascun laboratorio un pacchetto speciale. Dentro c’erano:

• Otto fiale, ognuna contenente un campione anonimo (alcuni con virus, altri “finti”).
• Due fiale di primer e sonde liofilizzati, pronti all’uso, per rilevare il virus Toscana (TOSV) e diverse specie del virus della Febbre da Pappataci Siciliana (SFSV) con una tecnica chiamata RT-PCR (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction) in tempo reale.
• Una fiala di primer liofilizzati per scovare i phlebovirus in generale, sempre con la RT-PCR, ma in versione “convenzionale”.
• Ovviamente, un protocollo operativo standard (SOP) bello dettagliato, per essere sicuri che tutti seguissero gli stessi passaggi.

Poi, abbiamo chiesto ai laboratori di inviarci i loro risultati, specificando anche le tecniche che avevano impiegato (tipo di kit per l’estrazione dell’RNA, macchinari, ecc.).

I Risultati: Luci e Qualche Ombra

E i risultati? Beh, sono stati molto incoraggianti! Tutti e nove i laboratori sono riusciti a identificare correttamente i due campioni positivi al TOSV e quello positivo all’SFSV usando i kit specifici che avevamo fornito. Questo è un gran bel segnale! Certo, abbiamo notato qualche variazione nei valori di Ct (Cycle threshold, un indicatore di quanto virus c’è nel campione), ma ci arriveremo.

La vera sfida è arrivata con il test generico per i phlebovirus. Qui, solo un laboratorio, utilizzando il suo saggio generico, è riuscito a beccare tutti i phlebovirus che avevamo inserito nel panel. Gli altri ne hanno trovati alcuni sì e altri no. Questo ci dice che i test specifici in real-time RT-qPCR sono più “sensibili” e affidabili per quei virus noti, mentre il test generico, pur essendo utile per scoprire magari nuovi virus, ha una sensibilità un po’ più bassa.

Parliamo un attimo del TOSV e dell’SFSV, perché sono tra i phlebovirus meglio caratterizzati e sono patogeni per l’uomo. Il TOSV è un tipaccio: può causare malattie febbrili, da sintomi simili all’influenza (febbre, mal di testa, stanchezza) fino a problemi neurologici più seri come meningiti ed encefaliti. L’SFSV, invece, è il responsabile della classica “febbre da pappataci” o “febbre dei tre giorni”: insorgenza improvvisa di febbre alta, forte letargia e malessere generale che dura circa 3-4 giorni. Nonostante la loro importanza, spesso vengono trascurati nei test diagnostici di routine, il che porta a sottostimare la loro reale diffusione.

Uno dei problemi principali nella ricerca e diagnosi degli SbPV è proprio la mancanza di strumenti diagnostici standardizzati e accessibili. Anche se esistono test specifici per il TOSV, non sono usati di routine ovunque. E, pensate un po’, non esiste un test “pan-generico” commerciale capace di rilevare tutti gli SbPV, nonostante siano stati descritti vari approcci. Questa carenza limita parecchio la sorveglianza e la nostra capacità di valutare l’impatto epidemiologico di questi virus.

L’Importanza della Sorveglianza sui Vettori

Non dimentichiamoci dei vettori! Studiare gli SbPV nei flebotomi ci dà informazioni preziose sulla specificità delle specie vettrici e sui cicli di trasmissione naturali. Sappiamo che Phlebotomus perniciosus e Ph. perfiliewi sono i principali vettori del TOSV, e Ph. papatasi quello dell’SFSV. Ma recenti studi suggeriscono che la varietà di specie di flebotomi capaci di trasmettere questi virus potrebbe essere più ampia di quanto pensassimo.

Tornando alla nostra EQA, i campioni che abbiamo inviato includevano sei virus inattivati (TOSV ceppo A, TOSV ceppo B, SFSV, Massilia virus (MASV), Punique virus (PUNV) e Arbia virus (ARBV)) e due campioni “mock” (plasma umano senza virus, per controllo). I virus erano stati inattivati col calore, per la sicurezza di tutti.

Abbiamo analizzato le tecniche usate dai laboratori: per l’estrazione dell’RNA, cinque laboratori hanno usato kit della Qiagen (quattro con metodi manuali), mentre altri hanno optato per kit di Resnova, Promega, Thermo Fisher Scientific e Precision System Science. Anche i volumi di partenza per l’estrazione variavano. Per la RT-qPCR, la maggior parte ha usato kit della Thermo Fisher Scientific o Meridian Bioscience.

Analisi Dettagliata dei Risultati e Implicazioni

Come dicevo, tutti e nove i laboratori hanno rilevato i due campioni positivi al TOSV (lineage A e B) e il campione SFSV. I valori di Ct, però, variavano: per il TOSV A da 25.9 a 32.8, per il TOSV B da 23.3 a 33.5, e per l’SFSV da 26.0 a 31.0. È interessante notare che quattro laboratori che usavano kit di estrazione manuale hanno riportato valori di Ct più alti. Questo potrebbe indicare una perdita di RNA durante l’estrazione, un fenomeno già osservato: l’estrazione manuale a volte porta a una resa di RNA virale inferiore rispetto ai protocolli automatizzati. Nessun laboratorio, per fortuna, ha avuto problemi di contaminazione.

Con il saggio Pan-Phlebovirus RT-PCR, la storia è stata un po’ diversa. Solo il laboratorio #1 ha rilevato tutti e sei i campioni positivi. Quattro laboratori ne hanno rilevati cinque, tre ne hanno rilevati tre e uno solo due. I virus Punique (PUNV) e Arbia (ARBV) sono stati rilevati da tutti, il Massilia (MASV) da otto. Il TOSV A e SFSV da cinque, e il TOSV B solo da uno con questo metodo generico. Questo conferma il compromesso tra ampio spettro di rilevamento e sensibilità ridotta dei saggi PCR pan-generici. I laboratori con Ct alti per TOSV e SFSV nei test specifici, infatti, non sono riusciti a rilevarli con il test Pan-Phlebovirus, che è meno sensibile.

Ma attenzione, gli obiettivi dei due tipi di test sono diversi:

• Il test specifico in tempo reale per TOSV serve per una logica di rilevamento/diagnosi.
• L’approccio pan-generico (come il Pan-SFSV, che rileva anche virus simili come Corfou, Dashli e Toros, e il Pan-Phlebovirus) è più aperto, mirato a scoprire nuovi virus o a valutare la presenza di virus noti in una data area geografica.

È importante sottolineare che l’identificazione della specie virale non faceva parte di questa EQA, perché richiede tecniche di sequenziamento aggiuntive.

Un Successo per la Collaborazione e la Capacità di Risposta

Si potrebbe obiettare che questo non è stato un EQA “puro”, visto che abbiamo fornito gli strumenti molecolari. I laboratori hanno messo del loro: tecniche di estrazione, kit di trascrizione inversa e Mastermix, e l’equipaggiamento PCR. Inoltre, la maggior parte dei laboratori partecipanti non eseguiva di routine il rilevamento molecolare degli SbPV prima di questo progetto (ad eccezione dei laboratori italiani e israeliani).

E qui sta il bello! I risultati soddisfacenti dimostrano che fornire reagenti liofilizzati per la diagnosi permette un rilevamento accurato, compatibile con i tempi di un progetto scientifico. Infatti, questi laboratori stanno ora implementando il rilevamento dei phlebovirus localmente, sui flebotomi catturati, senza dover spedire materiale a un laboratorio di riferimento. Questo getta le basi per dispiegare rapidamente capacità di rilevamento o diagnosi in siti che hanno gli strumenti tecnici, anche in assenza di competenze specifiche pregresse nel campo.

L’obiettivo di questa EQA non era solo testare le capacità dei laboratori, ma anche migliorare l’uso degli strumenti molecolari. Vogliamo che le istituzioni di ricerca possano avviare o partecipare a programmi di ricerca e sorveglianza nel campo della “scoperta di virus” o del “rilevamento di virus”, andando oltre le loro aree di competenza primaria. Rafforzando infrastrutture e competenze, queste iniziative migliorano la capacità di condurre diagnosi molecolari accurate e tempestive, contribuire alla ricerca e sviluppo, e rispondere efficacemente alle sfide emergenti per la salute pubblica. La collaborazione e la condivisione di conoscenze tra laboratori internazionali sono cruciali.

In conclusione, questa EQA, condotta nell’ambito del progetto EU CLIMOS, ha armonizzato con successo il rilevamento molecolare degli SbPV da parte di nove laboratori. Questo ci permetterà di ottenere dati confrontabili per i modelli di impatto climatico e ambientale. Lo studio ha confermato l’alta sensibilità dei test RT-qPCR specifici per TOSV e SFSV, mentre il saggio Pan-Phlebovirus RT-PCR si è dimostrato valido per un rilevamento più ampio, seppur con minore sensibilità. Le variazioni nei valori di Ct, specialmente quelli più alti dai laboratori con estrazione manuale dell’RNA, suggeriscono una probabile perdita di RNA durante l’estrazione.

Ma la cosa più importante è che questa EQA ha facilitato l’implementazione di strumenti di rilevamento molecolare in laboratori precedentemente inesperti, dimostrando la fattibilità di uno screening virale decentralizzato. Oltre a valutare le capacità di rilevamento, abbiamo mirato a rafforzare la capacità molecolare, supportando gli sforzi di sorveglianza e scoperta dei virus. Promuovendo la collaborazione internazionale, miglioriamo la preparazione alle malattie infettive emergenti e contribuiamo alla sicurezza sanitaria globale. Un piccolo passo per noi, ma speriamo un grande passo per la lotta contro questi virus nascosti!

Fonte: Springer