RW: Vi presento il nuovo pesce zebra “campione” che sta cambiando la ricerca!

Ciao a tutti, appassionati di scienza e curiosi! Oggi voglio parlarvi di un piccolo amico che sta facendo grandi cose nel mondo della ricerca: il pesce zebra, o Danio rerio per gli amici scienziati. Probabilmente ne avete già sentito parlare: è un modello animale fantastico, soprattutto per chi studia genetica e sviluppo, grazie alla sua velocità nel riprodursi e alla trasparenza dei suoi embrioni. Un vero libro aperto sulla biologia!

Per decenni, due “famiglie” principali di zebrafish, chiamate AB e TU, hanno dominato i laboratori. Sono state utilissime, non fraintendetemi, ma come in tutte le famiglie, anche loro hanno i loro “acciacchi”: studi recenti mostrano che linee diverse possono avere comportamenti complessi differenti e una diversa suscettibilità a certe condizioni in età adulta. Inoltre, con la ricerca che avanza a passi da gigante in tantissimi campi, c’era un bisogno crescente di avere a disposizione nuove linee di zebrafish, magari geneticamente un po’ diverse e, soprattutto, prive di quelle fastidiose varianti genetiche “difettose” che possono complicare gli esperimenti.

Nasce una nuova stella: la linea RW!

Ed è qui che entriamo in gioco noi! Voglio presentarvi la linea RIKEN Wild-type (RW). Questa linea ha una storia interessante: è nata originariamente da pesci presi in un negozio di animali nel Michigan, USA, ma è stata “adottata” e cresciuta con cura qui in Giappone fin dal 1991. Ma non pensate a un allevamento qualsiasi! Abbiamo seguito un protocollo super rigoroso.

Immaginatevi un “casting” continuo: per ogni ciclo riproduttivo, mettevamo insieme due coppie di pesci adulti. Poi, osservavamo attentamente i loro piccoli per i primi 5 giorni di vita. Scartavamo senza pietà tutte le “cucciolate” che mostravano anche il minimo difetto di sviluppo o mortalità anomala. Solo i gruppi di embrioni perfettamente sani e forti venivano fatti crescere. E solo gli adulti più in forma venivano scelti per la generazione successiva. Questo processo, ripetuto circa una volta al mese dal 1997 presso il RIKEN, ci ha permesso di eliminare gradualmente tutte quelle varianti genetiche “sfortunate” che causavano problemi di sviluppo, fragilità o scarsa fertilità. Il risultato? Oggi è rarissimo vedere embrioni RW con problemi. Una linea robusta, sana e con ottime capacità riproduttive: un vero gioiello per noi ricercatori!

Un’occhiata sotto il cofano: il DNA della linea RW

Ma non ci siamo fermati all’aspetto e alla salute. Volevamo capire cosa rendesse la linea RW davvero speciale a livello genetico. Così, abbiamo fatto quello che si chiama Sequenziamento dell’Intero Genoma (WGS). In pratica, abbiamo letto l’intero “libretto di istruzioni” genetico di alcuni individui RW e lo abbiamo confrontato con quello di altre linee famose come AB, TU, TL, WIK, SAT, NHGRI-1, PET, e anche con linee speciali come *AB, IND, M-AB e IM (queste ultime sono linee “inbred”, cioè con pochissima variabilità genetica, quasi cloni).

Cosa abbiamo scoperto? Un sacco di cose interessanti! Abbiamo identificato milioni di piccole differenze nel DNA (chiamate SNP, Single Nucleotide Polymorphisms) tra le varie linee. Pensate che queste differenze rappresentano quasi il 3% dell’intero genoma dello zebrafish! Come ci aspettavamo, la linea TU aveva meno SNP rispetto alle altre, perché il genoma di riferimento che usiamo è proprio quello della linea TU. Ma la cosa più intrigante è che la linea RW ha mostrato un numero di SNP più alto rispetto ad AB, SAT e NHGRI-1, suggerendo che sia geneticamente più “distante” dalla linea TU rispetto a queste altre.

L’albero genealogico dei pesci zebra: RW fa gruppo a sé

Per visualizzare meglio queste relazioni, abbiamo costruito un albero filogenetico, una specie di albero genealogico basato sul DNA. Abbiamo usato anche due specie “cugine” dello zebrafish come punto di riferimento esterno. I risultati sono stati chiari:

• Le linee AB, TU, SAT e NHGRI-1 si sono raggruppate insieme, confermando la loro stretta parentela (SAT e NHGRI-1 derivano da incroci tra AB e TU). Anche le linee *AB, M-AB, IND e IM sono finite in questo “super-gruppo”.
• Le linee TL e PET formavano un altro gruppetto separato.
• La linea WIK, che viene da pesci selvatici catturati in India, era molto distante da tutte le altre, confermando la sua unicità.
• E la nostra RW? Ha formato un gruppo completamente indipendente! È geneticamente distinta dalle altre linee più comuni. Una vera “originale”!

Quanto è varia la linea RW? Uno sguardo all’eterozigosi

Un altro aspetto importante è la variabilità genetica all’interno di una linea, chiamata tecnicamente eterozigosi. Più alta è l’eterozigosi, maggiore è la diversità genetica. Abbiamo misurato questo parametro e scoperto che l’eterozigosi della linea RW (circa 0.348%) è paragonabile a quella delle linee AB e WIK. È più alta di quella di TU, SAT e NHGRI-1, ma leggermente più bassa di quella della linea PET. Questo significa che la linea RW mantiene un buon livello di diversità genetica interna, il che è ottimo per la robustezza e per evitare problemi legati all’eccessiva consanguineità. Al contrario, le linee inbred M-AB e IM, come previsto, avevano un’eterozigosi bassissima, quasi zero.

Segni particolari: le varianti genetiche uniche della linea RW

Andando ancora più a fondo, ci siamo concentrati su quelle varianti genetiche (SNP) che erano presenti in forma “omozigote” (cioè ereditate da entrambi i genitori) in tutti gli individui di una stessa linea e che potevano potenzialmente “rompere” o alterare la funzione di un gene. Ne abbiamo trovate parecchie in tutte le linee, ma molte erano condivise tra più linee, suggerendo che forse alcune annotazioni nel database dei geni potrebbero non essere perfette.

La cosa davvero eccitante è stata identificare le varianti “rompi-gene” uniche per ciascuna linea, quelle che ne definiscono le caratteristiche genetiche specifiche. Ad esempio, la linea TL ha una mutazione nota nel gene leot1 che le dà il suo tipico pattern a macchie invece che a strisce. E la linea RW? Abbiamo trovato ben 13 geni che portano varianti potenzialmente disruptive uniche per lei! Tra questi ci sono geni come sult3st1, ighv 1-2, nexmifa, nitr3r.1 L, nitr7a, mvb12bb, steap3, sctr, stk39, golga4, urb1, invs, e cyp2x6.

Abbiamo dato un’occhiata più da vicino ad alcuni di questi geni unici di RW. Per esempio, il gene nexmifa è coinvolto nello sviluppo dei neuroni motori, ma nonostante la variante trovata in RW, i nostri pesci non mostrano difetti motori. Forse c’è un meccanismo di compensazione? Similmente, il gene urb1 è importante per la crescita degli organi digestivi e invs è legato alla formazione di cisti renali. Anche in questi casi, le varianti presenti in RW non sembrano causare i problemi osservati quando questi geni vengono “spenti” artificialmente in altri esperimenti. Questo ci ricorda che la genetica è complessa e non sempre una variante che sembra “brutta” sulla carta ha poi effetti negativi sull’organismo. Potrebbero esserci altri geni che compensano, o forse la funzione di questi geni non è ancora compresa appieno, o ancora, le annotazioni dei geni potrebbero aver bisogno di una revisione.

Perché la linea RW è una risorsa preziosa?

Quindi, ricapitolando, cosa rende la linea RW così speciale e utile?

• Robustezza: Grazie al rigoroso processo di selezione, i pesci RW sono sani, si riproducono bene e sono facili da mantenere in laboratorio.
• Distinzione Genetica: L’analisi filogenetica ha dimostrato che RW è un gruppo a sé, distinto dalle linee comuni come AB e TU. Questo offre una nuova base genetica per studiare la diversità all’interno della specie.
• Caratteristiche Uniche: Possiede varianti genetiche uniche che potrebbero influenzare tratti specifici, aprendo nuove strade per la ricerca su come i geni influenzano il comportamento, la suscettibilità alle malattie, la risposta ai farmaci o persino il microbioma intestinale.
• Ottima per la Sperimentazione: Gli embrioni RW sono perfetti per tecniche avanzate come la microiniezione (per knockdown genico con morfolini, transgenesi Tol2) e l’editing del genoma con CRISPR/Cas9, come già dimostrato in diversi studi che l’hanno utilizzata.

In conclusione, la creazione e la caratterizzazione della linea RW rappresentano un passo avanti importante per la comunità scientifica che utilizza lo zebrafish. Offre una nuova risorsa, robusta e geneticamente ben definita, che ci aiuterà a esplorare la diversità genetica di questa specie e a capire meglio come piccole differenze nel DNA possano portare a grandi differenze nelle caratteristiche biologiche. E la buona notizia è che la linea RW è disponibile per i ricercatori di tutto il mondo tramite il National BioResource Project (NBRP) in Giappone. Non vediamo l’ora di scoprire cosa emergerà dagli studi futuri che utilizzeranno questo nuovo, affascinante “campione”!

Fonte: Springer