Batteri Kamikaze: Come ho trasformato una tossina batterica in un’arma contro le infezioni

Ciao a tutti! Oggi voglio raccontarvi una storia affascinante, una di quelle avventure scientifiche che ti fanno battere il cuore. Parliamo di un nemico invisibile ma potentissimo: la resistenza agli antibiotici. È un problema globale che cresce a vista d’occhio e ci mette tutti a rischio. Servono urgentemente nuove armi, nuovi antibiotici con meccanismi d’azione diversi, magari capaci di non far sviluppare facilmente resistenza ai batteri. E se vi dicessi che una possibile soluzione potrebbe nascondersi… proprio dentro i batteri stessi? Sembra un paradosso, vero? Eppure, è proprio da lì che siamo partiti.

Un’idea un po’ folle: usare le armi del nemico

Avete mai sentito parlare dei sistemi Tossina-Antitossina (TA) di tipo I? Sono meccanismi genetici diffusissimi nei batteri. Immaginateli come un interruttore on/off genetico: c’è un gene “tossina” che produce un piccolo peptide (una mini-proteina) idrofobico, spesso letale per il batterio stesso se prodotto in eccesso, e un gene “antitossina” che produce un piccolo RNA (sRNA) capace di bloccare la produzione della tossina. Il ruolo biologico preciso di queste tossine, spesso associate alle membrane cellulari, non è ancora del tutto chiaro, ma una cosa è certa: se le fai produrre in grandi quantità, il batterio muore. E qui scatta l’idea: e se potessimo usare queste tossine naturali come base per creare nuovi antibiotici sintetici da somministrare dall’esterno?

Nel nostro studio, ci siamo concentrati su una tossina specifica chiamata ShoB, proveniente dal sistema shoB-ohsC del batterio Escherichia coli (il famoso E. coli). L’obiettivo era capire se potevamo prendere questa tossina, modificarla un po’, e trasformarla in un peptide antimicrobico efficace, ma somministrabile come un farmaco.

La sfida iniziale: domare la tossina

Il primo ostacolo? La tossina ShoB naturale, così com’è, è un osso duro. È molto idrofobica, il che significa che odia l’acqua (e i nostri fluidi corporei sono principalmente acqua!). Infatti, quando abbiamo provato a sintetizzarla chimicamente e a metterla in colture batteriche, precipitava immediatamente. Impossibile testarne l’efficacia in quel modo. Bisognava renderla più “socievole” con l’acqua, più solubile, senza però farle perdere la sua capacità di uccidere i batteri.

La nostra strategia iniziale è stata quella di “ingentilire” la sequenza. Abbiamo sostituito alcuni amminoacidi idrofobici con altri carichi positivamente (cationici), come la lisina (K). Questo non solo aumenta la solubilità, ma spesso aiuta i peptidi antimicrobici (AMPs) a interagire con le membrane batteriche, che sono cariche negativamente. Abbiamo anche sostituito una cisteina all’inizio della sequenza per evitare che i peptidi si appiccicassero tra loro. Il risultato è stato il peptide 1a.

Questo nuovo peptide era solubile e, cosa più importante, le previsioni strutturali suggerivano che mantenesse la forma ad alfa-elica, cruciale per l’interazione con le membrane, proprio come la tossina originale. E i test? Promettenti! Il peptide 1a ha mostrato un’attività ad ampio spettro contro diversi batteri patogeni umani, con concentrazioni minime inibitorie (MIC) ragionevoli (8-32 µM). Non solo inibiva la crescita, ma era anche battericida, cioè uccideva attivamente i batteri a concentrazioni vicine alla MIC. Un ottimo punto di partenza!

Rifinire l’arma: accorciare e ottimizzare

Abbiamo provato anche a sostituire le lisine con le arginine (R), un trucco che a volte potenzia l’attività degli AMPs. Sorprendentemente, nel nostro caso (peptide 1b), l’attività è diminuita. A volte la biologia ti sorprende!

Allora ci siamo chiesti: possiamo rendere il peptide più corto e mantenere l’efficacia? Peptidi più corti sono più facili ed economici da produrre. Per farci un’idea, siamo tornati al batterio. Abbiamo usato un sistema plasmidico per far esprimere a E. coli versioni “troncate” della tossina ShoB originale, togliendo pezzi dall’inizio (N-terminale) o dalla fine (C-terminale). Abbiamo visto che potevamo togliere diversi amminoacidi dall’inizio senza perdere troppa tossicità interna, ma la parte finale sembrava molto più critica.

Basandoci su questi risultati “interni”, abbiamo creato versioni sintetiche accorciate del nostro peptide 1a (1a-N5, 1a-N9, 1a-N10, 1a-C3, 1a-C5) e le abbiamo testate dall’esterno. I risultati hanno confermato le indicazioni: le versioni accorciate all’N-terminale (come 1a-N9 e soprattutto 1a-N10) mantenevano o addirittura miglioravano l’attività contro alcuni batteri, specialmente E. coli. Il peptide 1a-N10, in particolare, si è rivelato il migliore del gruppo, attivo contro tutti i batteri testati. Al contrario, tagliare la parte finale (C-terminale) ha drasticamente ridotto o annullato l’attività. Sembra proprio che il “cuore” e la coda del peptide siano fondamentali!

Abbiamo fatto altri tentativi per ottimizzare ulteriormente 1a-N10, provando ancora con le arginine o inserendo piccoli “distanziatori” (PEG), ma senza ottenere miglioramenti significativi rispetto a 1a-N10. A volte, la semplicità vince.

Velocità d’azione e resistenza alla degradazione

Avere un peptide attivo è bello, ma quanto è veloce ad agire? E quanto resiste agli enzimi del nostro corpo (le proteasi) che potrebbero degradarlo prima che faccia effetto? Abbiamo condotto esperimenti “time-kill” su E. coli con i nostri candidati migliori (1a, 1a-N5, 1a-N9, 1a-N10). I risultati sono stati entusiasmanti: 1a e 1a-N10 erano incredibilmente rapidi, eliminando quasi tutti i batteri in appena mezz’ora alla loro concentrazione battericida minima (MBC)! Gli altri due erano un po’ più lenti e abbiamo notato una tendenza alla ricrescita batterica dopo qualche ora, forse a causa della degradazione del peptide o della selezione di batteri più tolleranti.

Questo ci ha portato al problema della stabilità. I peptidi fatti con i normali L-amminoacidi sono facilmente attaccabili dalle proteasi. Una strategia comune è sostituire alcuni o tutti gli L-amminoacidi con i loro “speculari”, i D-amminoacidi, che le proteasi non riconoscono. Abbiamo creato una versione di 1a con la parte finale (quella critica!) fatta di D-amminoacidi (D-1a) e una versione completamente D di 1a-N10 (D-1a-N10).

Come previsto, questi peptidi “D” erano molto più resistenti alla degradazione da parte della tripsina (una proteasi comune). Mentre le versioni L perdevano attività dopo un’ora di trattamento con tripsina, le versioni D la mantenevano intatta anche dopo 6 ore. Anzi, è successa una cosa strana e interessante: D-1a sembrava diventare *più* attivo dopo il trattamento con tripsina! Forse la proteasi tagliava via un pezzetto della parte L iniziale, generando un frammento ancora più potente. Misteri della biochimica! L’attività antibatterica di queste versioni D era generalmente simile o addirittura migliore rispetto alle forme L, a seconda del batterio.

La domanda cruciale: e la resistenza?

Uno dei grandi vantaggi sperati per gli AMPs è la loro bassa propensione a indurre resistenza. Abbiamo messo alla prova i nostri quattro migliori candidati (1a, 1a-N10, D-1a, D-1a-N10) con un test specifico per misurare la frequenza con cui E. coli sviluppa spontaneamente mutazioni di resistenza (Frequency of Resistance, FoR). Abbiamo usato la colistina, un antibiotico di ultima istanza, come riferimento.

I risultati sono stati molto incoraggianti. I peptidi L (1a e 1a-N10) hanno mostrato una frequenza di resistenza bassa, paragonabile a quella della colistina. Ma la vera sorpresa sono state le versioni D (D-1a e D-1a-N10): con questi peptidi, non siamo riusciti a rilevare *nessuna* mutazione di resistenza! Zero! Questo potrebbe essere dovuto alla loro maggiore stabilità (mantengono una pressione selettiva costante) o forse a un meccanismo d’azione che rende più difficile per i batteri adattarsi, magari destabilizzando pesantemente le membrane. Osservazioni preliminari al microscopio sembrano suggerire che i peptidi D causino danni visibili alle membrane batteriche più rapidamente dei peptidi L.

L’ostacolo finale: la tossicità

Sembrava tutto troppo bello, vero? Peptidi potenti, veloci, stabili e con bassa tendenza alla resistenza… ma c’è sempre un “ma”. La selettività. Un buon antibiotico deve uccidere i batteri senza danneggiare le nostre cellule. Abbiamo testato la tossicità dei nostri quattro campioni sui globuli rossi umani (test di emolisi). E qui, purtroppo, sono arrivate le note dolenti.

I nostri peptidi, specialmente a concentrazioni più alte, mostravano una significativa attività emolitica, cioè danneggiavano i globuli rossi. E, ironia della sorte, le modifiche con D-amminoacidi, così vantaggiose per stabilità e resistenza, sembravano peggiorare questo problema. La sfida della selettività rimane aperta.

Conclusioni e prospettive future

Allora, cosa abbiamo imparato da questa avventura? Che le tossine batteriche dei sistemi TA di tipo I sono davvero una miniera d’oro potenziale per scovare nuove strutture di partenza per antibiotici peptidici. Abbiamo dimostrato che è possibile trasformare una tossina idrofobica e “intrattabile” come ShoB in peptidi sintetici solubili, potenti, stabili e che inducono poca resistenza, come il nostro 1a-N10 e la sua versione D, D-1a-N10.

La strada però è ancora lunga. Il problema principale da risolvere è la tossicità verso le cellule umane. Serviranno ulteriori modifiche, un design ancora più razionale per aumentare la selettività. Un’altra via potrebbe essere quella della formulazione: magari “impacchettare” questi peptidi in nanoparticelle potrebbe ridurre la loro tossicità sistemica e migliorare la loro efficacia.

Insomma, il viaggio è appena iniziato, ma la direzione sembra promettente. Aver dimostrato che si può partire da una tossina batterica per creare potenziali antibiotici apre scenari davvero interessanti nella lotta contro l’antibiotico-resistenza. Continueremo a scavare in questa miniera!

Fonte: Springer