ENaC Sotto la Lente: Come Stiamo Rivoluzionando la Caccia ai Farmaci con il Patch-Clamp Automatizzato!

Ciao a tutti, appassionati di scienza e scoperte! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel mondo della ricerca farmacologica, un campo dove ogni piccola innovazione può fare una differenza enorme per la salute di milioni di persone. Parleremo di un protagonista un po’ misconosciuto ma fondamentale: il canale epiteliale del sodio, o più semplicemente ENaC. E vi racconterò come stiamo usando una tecnologia super avanzata, il patch-clamp automatizzato (APC), per scovare nuove molecole capaci di regolarlo.

ENaC: Un Canale Ionico Vitale, Ma Occhio ai Guai!

Immaginate l’ENaC come una sorta di guardiano cellulare che controlla l’ingresso del sodio nelle cellule di tessuti importantissimi come i polmoni e i reni. Questo suo ruolo è cruciale: aiuta a mantenere l’equilibrio dei fluidi nel corpo, la pressione sanguigna sotto controllo e persino la funzionalità polmonare. Insomma, un lavoratore instancabile e silenzioso.

Però, come in tutte le storie più avvincenti, c’è un “ma”. Se l’ENaC lavora troppo (iperattività) o troppo poco (ipoattività), possono sorgere problemi seri. Pensate all’ipertensione arteriosa resistente ai sali, dove un ENaC troppo zelante contribuisce ad alzare la pressione. O, al contrario, a malattie come la fibrosi cistica o l’edema polmonare, dove una sua ridotta funzionalità peggiora la situazione. Capite bene, quindi, perché l’ENaC sia diventato un bersaglio farmacologico così interessante: trovare molecole che possano “calmarlo” o “stimolarlo” a dovere aprirebbe la strada a nuove terapie mirate.

La Sfida: Cercare l’Ago nel Pagliaio Farmacologico

Finora, i farmaci che modulano l’ENaC non sono tantissimi. L’amiloride è forse il più noto, usato come diuretico per l’ipertensione, ma non è super specifico e ha i suoi limiti, specialmente se pensiamo a un’applicazione polmonare. C’è un gran bisogno, quindi, di nuovi inibitori (per frenare un ENaC iperattivo) e attivatori (per dare una spinta a un ENaC pigro) che siano più specifici, efficaci e magari con meccanismi d’azione innovativi.

Una caratteristica unica dell’ENaC è la sua attivazione tramite un processo chiamato clivaggio proteolitico. In pratica, delle forbicine molecolari (proteasi) tagliano via dei pezzettini inibitori dal canale, scatenandone l’attività. Questo ci dà un’idea: potremmo disegnare farmaci che mimano questi pezzettini inibitori o che, al contrario, favoriscano l’attivazione.

Il problema è: come si fa a testare migliaia, se non milioni, di potenziali candidati farmaci in modo rapido ed efficiente? La tecnica “gold standard” per studiare i canali ionici come l’ENaC è il patch-clamp manuale. È una tecnica potentissima, che ci permette di “ascoltare” letteralmente la corrente elettrica che passa attraverso un singolo canale o un’intera cellula. Però, diciamocelo, è un lavoro da certosini: lento, laborioso e che richiede una manualità incredibile. Immaginate di dover fare questo per ogni singola sostanza da testare… un incubo per lo screening su larga scala!

Entra in Scena il Patch-Clamp Automatizzato (APC): La Nostra Scommessa!

Ed è qui che entra in gioco la tecnologia che stiamo mettendo a punto: il patch-clamp automatizzato (APC). Pensatelo come un esercito di robot ultra-precisi che fanno il lavoro del patch-clamp manuale, ma su centinaia di cellule contemporaneamente! Questo aumenta drasticamente la velocità e la quantità di composti che possiamo analizzare, aprendo le porte a uno screening ad alta produttività (HTS).

Nel nostro studio, ci siamo posti l’obiettivo di adattare e validare questa tecnica APC, usando un sistema chiamato SyncroPatch 384 (capace di analizzare 384 campioni in parallelo!), per studiare specificamente l’ENaC. Volevamo essere sicuri che questo approccio fosse affidabile sia per scovare nuovi inibitori che nuovi attivatori.

Messa a Punto del Sistema: Dalle Cellule Giuste alla Prova dei Fatti

Il primo passo è stato trovare le “cavie” giuste. Abbiamo usato delle cellule HEK293, una linea cellulare molto usata in laboratorio, che erano state geneticamente modificate per esprimere stabilmente le tre subunità (α, β, e γ) dell’ENaC umano. Con tecniche biochimiche (come il western blot) e con il patch-clamp manuale tradizionale, abbiamo confermato che queste cellule producevano ENaC funzionante. Una cosa interessante che abbiamo notato è che, mentre la subunità α dell’ENaC era prevalentemente nella sua forma “clivata” (cioè già processata dalle proteasi cellulari), la subunità γ era per lo più “intatta”, non clivata. Questo spiegava perché, nei nostri esperimenti manuali, l’aggiunta di una proteasi come la chimotripsina aumentava enormemente la corrente di ENaC (circa dieci volte!): andava a clivare quella subunità γ, attivando il canale.

Poi, siamo passati all’APC. Per preparare le cellule per l’analisi automatizzata, di solito si usa un trattamento enzimatico (noi abbiamo usato TrypLE, una sorta di tripsina ricombinante) per staccarle delicatamente dalla piastra di coltura e ottenere una sospensione di cellule singole. E qui abbiamo avuto una prima, importante osservazione.

L’Inghippo Enzimatico e la Soluzione “Recovery”

Ci siamo accorti che il TrypLE, essendo esso stesso una proteasi, causava una parziale attivazione proteolitica dell’ENaC già durante la preparazione delle cellule! Questo non era ideale, perché se l’ENaC è già un po’ attivato, diventa più difficile vedere l’effetto di un potenziale attivatore che agisce con lo stesso meccanismo. Infatti, l’effetto stimolatorio della chimotripsina nelle misurazioni APC era minore rispetto a quello che vedevamo nel patch-clamp manuale (dove le cellule non subivano questo pre-trattamento).

Abbiamo provato anche metodi di distacco non enzimatici, usando ad esempio il citrato di sodio. Questi metodi non attivavano l’ENaC, il che era ottimo, ma la percentuale di successo delle registrazioni APC crollava drasticamente (meno del 10% contro il 75% con TrypLE). Non era una strada percorribile per lo screening su larga scala.

Allora ci è venuta un’idea: e se, dopo il trattamento con TrypLE, lasciassimo le cellule “riprendersi” per qualche ora in terreno di coltura a 37°C? La nostra ipotesi era che, durante questo periodo di “recovery”, le cellule avrebbero internalizzato l’ENaC clivato e avrebbero esposto in superficie nuovo ENaC non clivato. Ebbene, ha funzionato! Dopo 4 ore di recupero, l’effetto stimolatorio della chimotripsina era significativamente maggiore, rendendo il sistema più sensibile per identificare attivatori che mimano l’attivazione proteolitica. E la cosa bella è che la percentuale di successo delle registrazioni rimaneva alta!

La Prova del Nove: Testare Attivatori e Inibitori Noti

A questo punto, dovevamo dimostrare che il nostro sistema APC, anche senza il protocollo di “recovery” (che è utile soprattutto per un certo tipo di attivatori), fosse in grado di identificare in modo affidabile sia gli attivatori che gli inibitori dell’ENaC. Abbiamo quindi testato alcuni modulatori già noti:

• L’amiloride: il classico inibitore. Come previsto, ha bloccato efficacemente le correnti ENaC.
• Un peptide inibitorio derivato dalla subunità γ (γ-11): anche questo ha mostrato un chiaro effetto inibitorio.
• S3969: una piccola molecola nota per attivare l’ENaC. Il nostro sistema APC ha rilevato chiaramente il suo effetto stimolatorio.

Questi esperimenti “proof-of-principle” ci hanno confermato che le registrazioni APC con il sistema SyncroPatch 384 sono adatte per identificare sia gli attivatori che gli inibitori dell’ENaC nelle nostre cellule HEK293. E con tassi di successo superiori al 70%, siamo pronti per lo screening su larga scala!

Cosa Significa Tutto Questo per il Futuro?

Beh, significa che abbiamo tra le mani uno strumento potente e affidabile per accelerare la scoperta di nuovi farmaci che modulano l’ENaC. La possibilità di testare rapidamente un gran numero di composti aumenta enormemente le chance di trovare quelle molecole “giuste” che potrebbero un giorno diventare terapie innovative per l’ipertensione, la fibrosi cistica, l’edema polmonare e altre patologie legate a un malfunzionamento dell’ENaC.

Certo, il passo successivo sarà testare questa metodologia anche su cellule native che esprimono ENaC endogenamente, come quelle delle vie aeree o del rene, per rendere lo screening ancora più vicino alla realtà fisiologica. Ma la base metodologica che abbiamo stabilito è solida e promettente.

È entusiasmante pensare che, grazie a queste tecnologie avanzate, stiamo aprendo nuove frontiere nella ricerca farmacologica. Chissà quali scoperte ci riserva il futuro! Io, nel frattempo, continuo il mio lavoro in laboratorio, con la speranza di contribuire, anche solo un pochino, a migliorare la vita delle persone. E spero di avervi trasmesso un po’ della passione che ci mettiamo!

Fonte: Springer