Citidina a Go-Go: Come Ho ‘Convinto’ Bacillus Subtilis a Darmi di Più!

Amici scienziati e curiosi di biotecnologie, mettetevi comodi perché oggi vi racconto una storia affascinante che arriva dritta dritta dal cuore pulsante della cellula, o meglio, di un batterio davvero speciale: il Bacillus subtilis. E il protagonista indiscusso? La citidina, una molecola piccola ma potentissima, un vero e proprio mattoncino fondamentale per creare farmaci antivirali e antitumorali. Pensate, la usiamo anche nel settore nutraceutico e per il benessere! Insomma, una celebrità nel mondo della chimica fine.

Da anni, noi ricercatori ci spremiamo le meningi per trovare modi sempre più efficienti per produrre questa citidina. Le vecchie vie, come la sintesi chimica tradizionale o l’idrolisi degli acidi nucleici, sono un po’ come usare un calesse quando hai a disposizione una Ferrari. Ecco perché ci siamo buttati sull’ingegneria metabolica, cercando di trasformare batteri come Escherichia coli o, appunto, il nostro Bacillus subtilis, in vere e proprie fabbriche cellulari super produttive. L’obiettivo? Tanta citidina, prodotta in modo economico e sostenibile.

Il Problema: Modificare i Geni Non Basta (Sempre)

Abbiamo provato di tutto: bloccare le vie metaboliche che “mangiano” la citidina, eliminare i meccanismi di feedback che dicono alla cellula “ok, basta così”, potenziare la fornitura dei precursori, ingegnerizzare i trasportatori cellulari e persino giocare con i cofattori. Strategie intelligenti, non c’è che dire. Però, c’è un “ma”. Spesso, modificare uno o due geni qua e là non basta per ottenere i risultati sperati. Anzi, a volte si rischia di fare un pasticcio, sregolando l’intero metabolismo centrale del batterio. Il risultato? Crescita stentata e accumulo di prodotto che lascia a desiderare. Un po’ come cercare di migliorare un’orchestra cambiando solo il violino o il flauto: il suono generale potrebbe non migliorare, anzi!

La Svolta: I Fattori di Trascrizione, i Nostri ‘Direttori d’Orchestra’ Metabolici

Qui entra in gioco la genomica funzionale e una categoria di molecole che io trovo semplicemente geniali: i fattori di trascrizione (TF). Immaginateli come dei direttori d’orchestra all’interno della cellula. Non suonano uno strumento specifico, ma coordinano l’intera sinfonia, dicendo a centinaia di geni quando e quanto “suonare”. Modificare questi TF ci permette di riprogrammare le reti metaboliche a livello globale, un po’ come dare un nuovo spartito all’intera orchestra, per indirizzare il flusso metabolico verso la sintesi del nostro prodotto desiderato, in questo caso, la citidina.

Nel Bacillus subtilis, la via di sintesi de novo delle pirimidine (la famiglia a cui appartiene la citidina) è regolata principalmente dall’operone pirimidinico (pyr operon). E chi tiene le redini di questo operone? Un fattore di trascrizione repressore chiamato PyrR. Quando PyrR si lega a specifiche sequenze, mette il freno alla trascrizione dei geni pyr. Se invece si lega a una molecola chiamata PRPP (un precursore importante), lascia via libera. Altri studi avevano già dimostrato che mettere KO il gene pyrR poteva aumentare la produzione di uridina, un’altra pirimidina.

Poi c’è un altro pezzo da novanta, CcpA (Catabolite Control Protein A). Questo è un vero e proprio boss che regola il metabolismo del carbonio e dell’azoto in B. subtilis, influenzando circa 300 geni! Parliamo di geni coinvolti nel trasporto e utilizzo delle fonti di carbonio, nel metabolismo degli acidi grassi a catena corta, nella via dei pentoso fosfati (importantissima per i precursori dei nucleotidi!), nel ciclo di Krebs e persino nel metabolismo dell’azoto. Insomma, CcpA ha le mani in pasta un po’ ovunque.

La nostra scommessa era: e se provassimo a “giocare” con PyrR e CcpA per spingere Bacillus subtilis a produrre più citidina? Abbiamo iniziato con un ceppo già ingegnerizzato (chiamato BSNX2), a cui avevamo tolto i geni cdd e udk per evitare che la citidina prodotta venisse degradata. Una base di partenza solida.

Primo Atto: Silenziare PyrR, il Guardiano delle Pirimidine

La prima mossa è stata mettere KO il gene pyrR. Immaginate PyrR come un vigile un po’ troppo zelante che blocca la strada alla produzione di citidina. Noi gli abbiamo detto: “Ehi, PyrR, prenditi una pausa!”. E il risultato? Il ceppo BSNX3, senza PyrR, ha iniziato a produrre 0.67 g/L di citidina in beuta, un aumento del 109.38% rispetto al ceppo di partenza! Non male, eh? L’analisi RT-qPCR ha confermato che i geni dell’operone pyr erano significativamente più attivi. Missione compiuta: meno repressione, più citidina.

Secondo Atto: Domare CcpA, il Boss del Carbonio e dell’Azoto

Poi è toccato a CcpA. Qui la faccenda si è fatta più complicata. Mettere semplicemente KO il gene ccpA (creando il ceppo BSNX4) non è stata una buona idea: la produzione di citidina è calata, così come il consumo di zuccheri e la biomassa. CcpA è un regolatore talmente centrale che eliminarlo del tutto scombussola troppo l’equilibrio della cellula. Era chiaro che serviva un approccio più raffinato.

Così, abbiamo deciso di non eliminarlo, ma di mutarlo. Abbiamo analizzato la struttura della proteina CcpA, che ha due domini principali: uno che lega il DNA (DBD) e uno che interagisce con altre proteine (DEBD). Abbiamo identificato alcuni amminoacidi in questi domini che variavano tra specie diverse di Bacillus e abbiamo creato delle “librerie di mutazioni”, cioè un sacco di versioni diverse di CcpA con piccole modifiche in questi punti strategici. Un po’ come cercare la combinazione giusta di una cassaforte.

Grazie a uno screening ad alta processività (immaginate di testare centinaia di batteri mutanti in piccole piastre), abbiamo pescato i campioni! In particolare, una mutazione nel dominio D1 (E43D) e un set di quattro mutazioni nel dominio D2 (S77A/M103L/S281A/P314K) si sono rivelate vincenti. Combinando queste cinque mutazioni nel ceppo BSNX3 (quello già senza PyrR), abbiamo ottenuto il nostro campione: il ceppo BSNX4-DM.

I Risultati? Da Urlo! (O Quasi)

E qui, signore e signori, tenetevi forte. Il ceppo BSNX4-DM ha prodotto ben 2.03 g/L di citidina in beuta! Un balzo incredibile rispetto ai 0.67 g/L del ceppo BSNX3. Non solo, anche la resa (grammi di citidina per grammo di glucosio consumato) e la produttività (grammi di citidina per litro all’ora) sono schizzate alle stelle. E la crescita cellulare? Migliorata!

Ma non ci siamo fermati qui. Abbiamo preso il nostro BSNX4-DM e l’abbiamo messo alla prova in un fermentatore da 5 litri, con una coltura fed-batch (cioè, aggiungendo nutrienti man mano). Ebbene, dopo 48 ore, abbiamo raggiunto la stratosferica cifra di 7.65 g/L di citidina! Un aumento di 3.77 volte rispetto alla beuta, con una resa di 0.06 g/g di glucosio e una produttività di 0.16 g/L/h. Mica male per un batterio “convinto” a lavorare per noi!

Dentro la ‘Scatola Nera’: Cosa Ci Dicono Genomica e Metabolomica

Ok, i numeri sono fantastici, ma come diavolo hanno fatto queste modifiche a PyrR e CcpA a scatenare tutta questa produzione di citidina? Per capirlo, abbiamo usato le armi pesanti della biologia dei sistemi: la trascrittomica (per vedere quali geni erano accesi o spenti) e la metabolomica (per misurare i livelli dei vari metaboliti nella cellula). È come aprire il cofano del nostro Bacillus subtilis ingegnerizzato e guardare il motore mentre gira.

• Effetto del knockout di PyrR:
  • Come previsto, i geni della via metabolica delle pirimidine erano significativamente sovraespressi. Più enzimi, più citidina!
  • Interessante, i geni della via delle purine (un’altra famiglia di nucleotidi) erano invece sottoespressi. Sembra che la cellula abbia dirottato le risorse verso le pirimidine.
  • A livello di metaboliti, abbiamo visto un aumento di UMP, OMP, UDP, citidina e citosina (tutti intermedi o prodotti della via delle pirimidine) e una diminuzione di adenosina, guanosina e adenina (legati alle purine). I conti tornano!
• Effetto della mutazione di CcpA (nel ceppo BSNX4-DM):
  • Anche qui, i geni chiave della via delle pirimidine erano belli attivi, portando a un aumento di OMP, UMP, UDP, CDP, CMP, citidina, citosina e uracile. La via delle purine, invece, era per lo più “calmata”.
  • Metabolismo del Carbonio: Qui CcpA ha fatto magie!
    • Il sistema PTS (che trasporta gli zuccheri nella cellula) era a palla: più glucosio entrava e più velocemente.
    • La via dei pentoso fosfati (PP pathway) era potenziata: questa via è cruciale perché produce R5P e PRPP, precursori fondamentali per la sintesi dei nucleotidi. Più PRPP, più “carburante” per fare citidina!
    • Anche il ciclo di Krebs (TCA) era più attivo, fornendo energia e intermedi.
  • Metabolismo dell’Azoto: I geni per la sintesi di glutammato e glutammina (donatori di azoto essenziali) erano sovraespressi. Più azoto disponibile per costruire i nucleotidi!
  • Metabolismo degli Amminoacidi: La sintesi di L-aspartato (un altro precursore chiave) era aumentata. Al contrario, le vie di sintesi di arginina, istidina e amminoacidi a catena ramificata erano ridotte. Questo significa che meno risorse venivano “sprecate” in vie metaboliche laterali, e più precursori erano disponibili per la nostra amata citidina.

In pratica, il knockout di PyrR ha tolto il freno specifico sulla via delle pirimidine. La mutazione di CcpA, invece, ha riprogrammato l’intera rete metabolica del carbonio e dell’azoto, come un abile stratega, per convogliare più precursori ed energia verso la sintesi della citidina. Un lavoro di squadra eccezionale tra le nostre modifiche genetiche!

Conclusioni: Un Futuro Brillante per le Fabbriche Microbiche

Questa avventura nel mondo di Bacillus subtilis ci ha insegnato tanto. Abbiamo visto che “zittire” PyrR è un buon punto di partenza per aumentare la produzione di citidina. Ma la vera svolta è arrivata “domando” CcpA attraverso mutazioni mirate, che hanno permesso di riorchestrare il metabolismo centrale in modo da supportare al meglio la sintesi del nostro prodotto.

Certo, la biosintesi della citidina coinvolge reti regolatorie complesse, e c’è ancora da scavare per capire appieno tutti i meccanismi con cui la CcpA mutata influenza il flusso metabolico globale. Ma i risultati sono lì, tangibili: 7.65 g/L di citidina! Queste strategie, che mirano a ottimizzare il livello trascrizionale globale delle reti metaboliche del carbonio e dell’azoto, aprono scenari entusiasmanti. Combinandole con altri approcci di ingegneria metabolica dei sistemi, potremo costruire fabbriche microbiche sempre più efficienti per produrre non solo citidina, ma un’ampia gamma di composti utili.

Il futuro della bioproduzione è qui, ed è scritto nel DNA (e nell’RNA, e nei metaboliti!) di questi incredibili microrganismi. E io, beh, non vedo l’ora di continuare a “dialogare” con loro per scoprire quali altri segreti sono disposti a svelarci!

Fonte: Springer