PRRSV: Svolta Epocale? Ecco il Vaccino “Intelligente” che Protegge i Suinetti e Smaschera l’Infezione!

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di una sfida enorme che noi, nel mondo della salute animale e dell’allevamento suino, affrontiamo da decenni: la Sindrome Riproduttiva e Respiratoria dei Suini, meglio conosciuta come PRRS. Causata da un virus birichino, il PRRSV, questa malattia è un vero incubo per gli allevatori, provocando gravi perdite economiche a causa di problemi riproduttivi nelle scrofe e complicazioni respiratorie nei maiali di tutte le età. Immaginate la frustrazione!

Il Nemico Invisibile: Il Virus PRRSV

Questo virus, un RNA virus della famiglia Arteriviridae, è un osso duro. Esiste principalmente in due “gusti”: il tipo 1 (PRRSV-1), più diffuso in Europa, e il tipo 2 (PRRSV-2), prevalente in America e Asia. Come se non bastasse, negli ultimi anni sono spuntate diverse varianti, rendendo il controllo ancora più complicato. In Cina, nel 2006, è emersa una forma particolarmente aggressiva, l’HP-PRRSV (Highly Pathogenic PRRSV-2), che ha causato stragi di suinetti. Un vero disastro.

Il Problema dei Vaccini Attuali

Certo, abbiamo dei vaccini vivi attenuati, sia per il tipo 1 che per il tipo 2. In Cina, ad esempio, si usano vaccini basati su ceppi come HuN4-F112, JXA1-P80, TJM-F92. Funzionano? Sì, ma con dei limiti. Innanzitutto, non sempre offrono una protezione completa contro ceppi diversi da quello vaccinale (protezione eterologa). Ma il problema più grande, quello che ci impedisce davvero di sradicare la malattia dagli allevamenti, è un altro: non esiste un modo semplice e commerciale per distinguere un maiale vaccinato da uno infettato naturalmente. Mancano i cosiddetti vaccini marcatori o DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) e i relativi test diagnostici. Senza questa distinzione, come fai a sapere quali animali eliminare per pulire l’allevamento? È come cercare un ago in un pagliaio!

L’Idea Geniale: Un Vaccino DIVA Basato sulla Proteina N

Ed è qui che entriamo in gioco noi, o meglio, la ricerca scientifica! L’obiettivo era chiaro: creare un vaccino vivo attenuato per PRRSV-2 che fosse non solo efficace e sicuro, ma anche marcatore. Come? Sfruttando le differenze tra PRRSV-1 e PRRSV-2 e una proteina chiave del virus: la proteina del nucleocapside, o proteina N.

Questa proteina è fondamentale per il virus, è molto abbondante e, cosa cruciale, stimola una forte risposta immunitaria (è immunogenica) e gli anticorpi contro di essa compaiono presto dopo l’infezione, già a 7 giorni. Perfetta come bersaglio!

In uno studio precedente, avevamo sviluppato un test speciale, un cELISA (competitive ELISA) basato su “nanobodies” (frammenti di anticorpi piccolissimi e specifici), capace di riconoscere solo gli anticorpi contro la proteina N del PRRSV-2. L’idea, quindi, è stata: prendiamo un ceppo molto aggressivo di PRRSV-2 (l’isolato SX-HD), creiamo una sua copia “addomesticata” in laboratorio (usando la tecnologia del clone infettivo cDNA), ma con un trucco: sostituiamo il gene della sua proteina N con quello della proteina N del PRRSV-1.

Il risultato? Un virus chimerico! I maiali vaccinati con questo virus produrranno anticorpi contro tutte le parti del PRRSV-2 *tranne* contro l’epitopo specifico della proteina N del tipo 2, quello riconosciuto dal nostro test cELISA. Invece, i maiali infettati dal virus selvaggio PRRSV-2 produrranno anche quegli anticorpi specifici. Bingo! Abbiamo il nostro marcatore!

Dalla Teoria alla Pratica: Creazione e Attenuazione

Non è stato facile, ve lo assicuro. Abbiamo costruito il clone cDNA del ceppo SX-HD (chiamato rSX-HD) e poi il clone chimerico con la proteina N scambiata (chiamato rSX-HD2M1). Siamo riusciti a “resuscitare” entrambi i virus in cellule speciali (le Marc-145). Il virus chimerico rSX-HD2M1, però, era ancora potenzialmente pericoloso, derivando da un ceppo altamente patogeno.

Quindi, abbiamo iniziato il lungo processo di attenuazione: abbiamo fatto replicare il virus rSX-HD2M1 in queste cellule per ben 120 passaggi, un processo che dura circa un anno! Ad ogni passaggio, il virus si adatta sempre più alle cellule e, di solito, perde la sua aggressività verso l’animale ospite. Abbiamo monitorato la crescita del virus e sequenziato il suo genoma ad intervalli regolari (ogni 10 passaggi) per vedere come cambiava.

Abbiamo scoperto che, nel corso dei 120 passaggi, il virus (che abbiamo chiamato rSX-HD2M1-F120 alla fine) aveva accumulato 17 mutazioni in amminoacidi, principalmente nelle proteine non strutturali (come la Nsp2) e in alcune proteine strutturali minori (GP2, GP4, GP5, M). È interessante notare che mutazioni simili sono state osservate anche in altri vaccini attenuati commerciali. La cosa più importante? La proteina N del PRRSV-1 che avevamo inserito è rimasta perfettamente stabile, senza nessuna mutazione! Questo era fondamentale per mantenere la funzione di marcatore.

La Prova del Nove: Sicurezza nei Suinetti

Era il momento della verità: il nostro candidato vaccino rSX-HD2M1-F120 era sicuro per i suinetti? Abbiamo preso dei suinetti sani, senza PRRSV, e li abbiamo divisi in gruppi:

• Gruppo 1: Infettato con il ceppo originale aggressivo SX-HD.
• Gruppo 2: Infettato con il virus chimerico non attenuato (rSX-HD2M1-F1).
• Gruppo 3: Vaccinato con il nostro candidato attenuato (rSX-HD2M1-F120).
• Gruppo 4: Gruppo di controllo (solo soluzione salina).

I risultati sono stati nettissimi. I suinetti dei gruppi 1 e 2 si sono ammalati gravemente: febbre alta (sopra i 40.5°C), perdita di appetito, problemi respiratori, e purtroppo, un’alta mortalità (80% e 60% rispettivamente). Al contrario, i suinetti vaccinati con rSX-HD2M1-F120 (gruppo 3) sono rimasti perfettamente sani, proprio come quelli del gruppo di controllo. Niente febbre, niente sintomi, crescita normale e 100% di sopravvivenza! Un sospiro di sollievo enorme.

Abbiamo anche monitorato la presenza del virus nel sangue (viremia) e nelle secrezioni nasali e anali. Nei gruppi 1 e 2, il virus era presente in grandi quantità e per lungo tempo. Nel gruppo 3 (vaccinati con F120), il virus è stato rilevato nel sangue a partire dal terzo giorno, ma a livelli molto più bassi e per un periodo più breve, scomparendo entro 21 giorni. Questo è normale per i vaccini vivi attenuati.

Infine, l’esame dei polmoni alla fine dell’esperimento (21 giorni) ha confermato tutto: lesioni gravissime nei gruppi 1 e 2, polmoni praticamente perfetti nei gruppi 3 e 4. La sicurezza era dimostrata!

Il Test DIVA Funziona?

E la capacità di distinguere? Abbiamo usato due test ELISA: uno commerciale (IDEXX) che rileva anticorpi contro entrambi i tipi di PRRSV, e il nostro cELISA specifico per la proteina N del PRRSV-2.

• IDEXX ELISA: Ha rilevato anticorpi nei gruppi 1, 2 e 3 a partire da 7-10 giorni dopo l’infezione/vaccinazione. Normale.
• Nanobody cELISA: Qui la magia! Ha rilevato anticorpi solo nel gruppo 1 (infettato con SX-HD selvaggio). Nei gruppi 2 e 3 (infettati/vaccinati con il virus chimerico rSX-HD2M1), questo test è rimasto negativo per tutto l’esperimento! Questo dimostra che il nostro sistema funziona: possiamo distinguere chi ha incontrato il virus selvaggio da chi è stato vaccinato con il nostro candidato.

La Prova Finale: Protezione dall’Infezione

Ok, il vaccino è sicuro e fa da marcatore. Ma protegge davvero da un’infezione successiva con un ceppo aggressivo? Abbiamo fatto un altro esperimento con suinetti di 6 settimane:

• Gruppo 1: Vaccinato con il nostro rSX-HD2M1-F120.
• Gruppo 2: Vaccinato con un vaccino commerciale attenuato (TJM-F92).
• Gruppo 3: Non vaccinato (controllo).
• Gruppo 4: Non vaccinato e non infettato (controllo negativo).

Dopo 21 giorni dalla vaccinazione, abbiamo infettato i gruppi 1, 2 e 3 con un altro ceppo HP-PRRSV molto cattivo, il JXA1. Il gruppo 4 ha ricevuto solo soluzione salina.

I risultati? Spettacolari! I suinetti del gruppo 3 (non vaccinati e infettati) si sono ammalati gravemente: febbre alta, sintomi clinici evidenti, crescita stentata e una mortalità del 60%. I suinetti dei gruppi 1 (vaccinati con F120) e 2 (vaccinati con TJM-F92), invece, sono rimasti perfettamente sani dopo l’infezione. Niente febbre, niente sintomi, crescita normale, 100% di sopravvivenza, proprio come il gruppo 4 (controllo negativo).

Abbiamo anche visto che la vaccinazione (sia con F120 che con TJM-F92) ha ridotto drasticamente la quantità di virus nel sangue e nelle secrezioni dopo l’infezione. E i polmoni? Alla fine dell’esperimento, i polmoni dei suinetti del gruppo 3 erano devastati. Quelli dei gruppi 1 e 2 erano quasi perfetti, con danni minimi o nulli, specialmente nel gruppo vaccinato con il nostro rSX-HD2M1-F120. Protezione confermata, e alla pari (se non leggermente meglio a livello di lesioni polmonari) di un vaccino commerciale!

Il Test DIVA Dopo l’Infezione: La Conferma Definitiva

E cosa è successo con i test anticorpali dopo l’infezione?

• IDEXX ELISA: Tutti i gruppi infettati (1, 2, 3) sono risultati positivi, come previsto.
• Nanobody cELISA: Qui la conferma finale. Prima dell’infezione, solo il gruppo 2 (vaccinato TJM-F92, che è un PRRSV-2) era positivo. Il gruppo 1 (vaccinato F120) era negativo. Ma dopo l’infezione con JXA1 (un PRRSV-2 selvaggio), anche i suinetti del gruppo 1 sono diventati positivi al nostro cELISA! Questo dimostra perfettamente il principio DIVA: il test distingue chi è solo vaccinato (negativo al cELISA) da chi è stato vaccinato E poi infettato (positivo al cELISA), o solo infettato (positivo al cELISA).

Cosa Significa Tutto Questo? Un Futuro Senza PRRSV?

Questo studio è davvero entusiasmante! Per la prima volta, abbiamo sviluppato una strategia concreta per un vaccino vivo attenuato DIVA contro il PRRSV-2, basato sulla sostituzione della proteina N. Il nostro candidato, rSX-HD2M1-F120, si è dimostrato:

• Sicuro: Non causa malattia nei suinetti.
• Efficace: Protegge contro un’infezione da ceppo HP-PRRSV aggressivo.
• Marcatore: Permette, in combinazione con il test cELISA specifico, di distinguere gli animali vaccinati da quelli infetti con ceppi selvaggi di PRRSV-2.

Questo apre finalmente la porta alla possibilità di implementare programmi di eradicazione efficaci per il PRRSV-2 negli allevamenti. Potremmo vaccinare gli animali per proteggerli e, allo stesso tempo, usare il test per identificare ed eliminare i portatori nascosti del virus selvaggio.

Certo, c’è ancora lavoro da fare. Dobbiamo verificare se questo vaccino protegge anche contro le nuove varianti emergenti, come le NADC30-like e NADC34-like. Inoltre, dobbiamo considerare il rischio, comune a tutti i virus a RNA, di ricombinazione tra il ceppo vaccinale e i ceppi selvaggi circolanti; forse in futuro si potranno sviluppare versioni non replicative per aumentare ulteriormente la sicurezza.

Ma la strada è tracciata. Questo approccio basato sulla proteina N e sul test cELISA specifico è una piattaforma promettente. Potremmo adattarla in futuro usando come base altri ceppi epidemici di PRRSV-2, sostituendo sempre la loro proteina N con quella del PRRSV-1.

Insomma, abbiamo tra le mani uno strumento potenzialmente rivoluzionario per combattere una delle malattie più devastanti per l’industria suinicola. La speranza di poter un giorno controllare ed eradicare il PRRSV-2 è oggi un po’ più concreta!

Fonte: Springer