NIS, Iodio e Biotrasformazione: Rivoluzioniamo i Test sugli Interferenti Tiroidei!

Ciao a tutti, appassionati di scienza e curiosi! Oggi voglio portarvi con me dietro le quinte di una ricerca che, credetemi, ha il potenziale per cambiare il modo in cui valutiamo la sicurezza delle sostanze chimiche che ci circondano. Parliamo di ormoni tiroidei, di come il nostro corpo li produce e di come alcune sostanze, un po’ subdole, possono mettere i bastoni tra le ruote a questo delicatissimo meccanismo.

L’Importanza degli Ormoni Tiroidei e le Minacce Chimiche

Gli ormoni tiroidei (TH) sono dei veri e propri direttori d’orchestra per il nostro organismo: essenziali per lo sviluppo, la crescita e il metabolismo di noi vertebrati. Immaginate quanto sia cruciale che tutto funzioni a puntino, specialmente durante lo sviluppo fetale! Purtroppo, siamo sempre più esposti a un cocktail di sostanze chimiche artificiali – pensate ai pesticidi, ai prodotti per la casa, ai cosmetici – e alcune di queste hanno la brutta fama di essere “interferenti endocrini”, cioè capaci di scombussolare il nostro sistema ormonale. E la tiroide, ahimè, è un bersaglio piuttosto sensibile.

Quando questi interferenti colpiscono la tiroide, si parla di THSD (Thyroid Hormone System Disruption), un problema che non riguarda solo noi umani, ma anche pesci, anfibi e altri animali. Negli esseri umani, alterazioni anche minime dei livelli di TH, soprattutto durante la gravidanza (la produzione di TH fetali inizia intorno all’undicesima settimana, ma il trasferimento materno è vitale fin da subito!), possono avere conseguenze a lungo termine sullo sviluppo neurologico. E non finisce qui: squilibri tiroidei sono stati collegati a disturbi come il disordine bipolare, l’Alzheimer e la depressione. Insomma, c’è un gran bisogno di metodi efficaci per scovare questi “guastafeste” chimici.

Il Ruolo Chiave del NIS e le Sfide della Valutazione

Ma come inizia la produzione degli ormoni tiroidei? Tutto comincia con l’assorbimento dello iodio (sotto forma di ione ioduro, I^–) dal sangue nelle cellule follicolari della tiroide. E qui entra in gioco una proteina superstar: il cotrasportatore sodio-iodio, o più semplicemente NIS (dall’inglese Sodium-Iodide Symporter). Questa proteina, codificata dal gene SLC5A5, si trova sulla membrana delle cellule tiroidee e, sfruttando un flusso di ioni sodio, pompa lo iodio all’interno della cellula contro gradiente, concentrandolo da 20 a 40 volte rispetto al sangue! Un lavoro pazzesco, vero?

Il problema è che altre sostanze con uno ione di raggio simile, come il perclorato (un contaminante ambientale) o il tiocianato (presente naturalmente in alcuni alimenti), possono “ingannare” il NIS e competere con lo iodio, inibendone l’assorbimento. Meno iodio assorbito significa meno ormoni tiroidei prodotti, portando a ipotiroidismo. Ma il NIS non è importante solo per la normale funzione tiroidea: gioca un ruolo cruciale anche nella diagnosi e nella terapia di alcuni tumori, specialmente quelli tiroidei, dove si usa lo iodio radioattivo. Quindi, sostanze che interferiscono con il NIS potrebbero non solo causare problemi di salute, ma anche compromettere l’efficacia di queste terapie salvavita.

Capite bene che identificare queste sostanze è fondamentale. Però, i test tradizionali in vivo (sugli animali) sono costosi, pongono questioni etiche e non sempre i risultati sono facilmente trasferibili all’uomo. C’è un bisogno urgente di quelli che chiamiamo “New Approach Methodologies” (NAMs), metodi alternativi più rapidi, economici e rilevanti. E qui, soprattutto per la valutazione dell’inibizione del NIS, c’era un po’ un vuoto, con pochi sistemi in vitro disponibili e, soprattutto, privi della capacità di mimare ciò che accade nel nostro corpo quando una sostanza viene metabolizzata.

La Nostra Proposta: Un Nuovo Saggio In Vitro Potenziato

Ed ecco dove entra in gioco il nostro studio! Ci siamo rimboccati le maniche per sviluppare e validare dei saggi biologici in vitro capaci di valutare come diverse sostanze chimiche influenzano l’assorbimento di iodio nelle cellule, proprio attraverso il NIS. Abbiamo lavorato con due nuove linee cellulari umane geneticamente modificate per esprimere abbondantemente il NIS umano, e le abbiamo affiancate a un modello cellulare classico, le cellule tiroidee di ratto FRTL-5. E per misurare lo iodio? Invece di usare isotopi radioattivi (che richiedono laboratori attrezzati e procedure complesse), abbiamo optato per la reazione colorimetrica di Sandell-Kolthoff (SK). Questa reazione si basa sull’effetto catalitico dello iodio su una reazione tra cerio(IV) e arsenico(III): più iodio c’è, più velocemente avviene la reazione, e noi possiamo misurarlo con uno spettrofotometro. Semplice ed efficace!

Abbiamo testato 23 composti modello – farmaci, prodotti industriali, pesticidi, composti perfluorurati – e i risultati sono stati molto incoraggianti, mostrando una buona comparabilità tra i diversi modelli in vitro e anche con i dati ottenuti in passato con metodi basati sulla radioattività. Questo già di per sé è un bel passo avanti, perché dimostra che il saggio SK è un’alternativa sensibile, robusta e adattabile anche per screening su larga scala.

Abbiamo prima verificato l’espressione del gene SLC5A5 (NIS) e della proteina NIS in diverse linee cellulari. Alcune, come le cellule tiroidee umane Nthy-ori 3-1 o le HEK293T “selvatiche” (non modificate), non esprimevano NIS. Invece, le nostre linee HEK293T transfettate (cioè in cui avevamo inserito il gene per il NIS umano) e le FRTL-5 di ratto mostravano livelli significativi di espressione genica e proteica. Tra le varie linee transfettate create, abbiamo selezionato le migliori, quelle con la più alta e stabile espressione di NIS e una buona capacità di assorbire iodio, come le HEK293T NIS 02 e HEK293T NIS C.

Biotrasformazione: Il Tocco di Realismo che Mancava

Ma la vera chicca del nostro lavoro, il vero avanzamento, è stato integrare nel saggio un sistema di biotrasformazione esterno (BTS). Cosa significa? Beh, quando ingeriamo una sostanza chimica, il nostro corpo, soprattutto il fegato, la “processa”, la modifica attraverso reazioni enzimatiche. Questo processo si chiama biotrasformazione o metabolismo xenobiotico, e può rendere una sostanza meno tossica (detossificazione) o, a volte, più tossica (bioattivazione). I normali saggi in vitro non tengono conto di questo aspetto cruciale, e questo è stato a lungo definito il “collo di bottiglia” nello sviluppo di test tossicologici in vitro affidabili.

Noi abbiamo quindi aggiunto un passaggio di pre-incubazione: prima di esporre le cellule alle sostanze chimiche, le abbiamo messe a contatto con delle frazioni S9. Le frazioni S9 sono preparati ottenuti da fegato di ratto (in questo caso, indotto con benzoflavone/fenobarbitale per potenziare l’attività enzimatica) che contengono un cocktail di enzimi metabolici, sia di fase I che di fase II, a cui abbiamo aggiunto i cofattori necessari per farli funzionare. L’obiettivo era ottimizzare questo sistema perché fosse compatibile con le cellule vive, senza causare citotossicità o interferire con il saggio stesso.

Per i composti che avevamo identificato come inibitori del NIS, abbiamo quindi ripetuto i test con questo sistema “potenziato”. E i risultati sono stati illuminanti!

Cosa Abbiamo Scoperto: Risultati e Confronti

Dei 23 composti testati inizialmente, nove si sono rivelati inibitori attivi del NIS, e sei di questi lo erano a concentrazioni non citotossiche in almeno due dei tre modelli cellulari. Per esempio, il perclorato (PCL), il triclosan (TCS), il bisfenolo A (BPA) e il dibutilftalato (DBP) hanno mostrato attività inibitoria. È fondamentale sottolineare l’importanza di valutare sempre la citotossicità parallelamente all’inibizione del NIS: un effetto tossico generale sulla cellula potrebbe essere erroneamente interpretato come un’inibizione specifica del NIS, portando a falsi positivi.

Tra i nostri modelli cellulari, la linea HEK293T NIS 02 si è dimostrata la più sensibile all’inibizione del NIS, mentre la NIS C, pur avendo livelli di espressione di NIS più alti, era più incline agli effetti citotossici e meno sensibile all’inibizione. Questo ci dice che non basta solo “ficcare” un gene in una cellula; conta anche dove si integra nel genoma e come questo influisce sulla salute generale della cellula. Il modello di ratto FRTL-5, con la sua espressione intrinseca di NIS, ha dato risultati generalmente coerenti con il modello HEK293T NIS 02, confermando la validità di quest’ultimo per studi di inibizione del NIS.

Confrontando i nostri dati con la letteratura, inclusi quelli del database ToxCast dell’EPA statunitense (che usa spesso metodi radioattivi), abbiamo trovato una buona concordanza. Questo suggerisce che il nostro saggio basato sulla reazione SK ha una sensibilità simile a quella dei metodi radioattivi, ma con il vantaggio di essere più accessibile e sicuro.

L’Impatto della Biotrasformazione: Non Tutte le Sostanze Reagiscono Uguale

E veniamo ora ai risultati con il sistema di biotrasformazione (BTS) integrato, usando la nostra linea cellulare “campione”, la HEK293T NIS 02. Abbiamo testato nove composti che erano risultati inibitori del NIS a concentrazioni non citotossiche: BPA, DBP, etoxazolo (ETX), metossicloro (MET), PCL, PFOS (acido perfluoroottansolfonico), resorcinolo (RSC), TCS e trifenilfosfato (TPP).

Abbiamo osservato tre scenari principali:

• Per alcuni composti, come DBP, TCS e BPA, l’attività metabolica del BTS ha ridotto significativamente la loro capacità di inibire il NIS. In pratica, il “fegato in provetta” li ha trasformati in qualcosa di meno dannoso per il NIS. Questo è un risultato importantissimo, perché suggerisce che per queste sostanze, i test in vitro standard potrebbero sovrastimare il rischio.
• Per un altro gruppo di composti (PCL, PFOS e RSC), non abbiamo osservato differenze significative. Sembra che questi composti non siano influenzati dalla biotrasformazione, almeno per quanto riguarda la loro capacità di inibire il NIS in questo specifico saggio.
• Infine, per composti più idrofobici (cioè che non amano l’acqua e tendono a legarsi ai grassi), come ETX, MET e TPP, abbiamo osservato pattern più complessi, probabilmente dovuti a questioni di biodisponibilità. Queste sostanze, a causa della loro idrofobicità (misurata dal log K_ow), potrebbero essersi “perse” legandosi alle pareti delle provette o evaporando durante la pre-incubazione, oppure interagendo con le proteine presenti nelle frazioni S9 (un effetto noto come “serum-mediated passive dosing” anche se qui non c’era siero). Questo ci dice che per sostanze molto idrofobiche (con log K_ow intorno o superiore a 5), il saggio con BTS va usato con cautela e magari ulteriormente ottimizzato.

Per dare un contesto a questi risultati sperimentali, abbiamo usato anche uno strumento in silico, BioTransformer 3.0, che predice i metaboliti di una sostanza. Le previsioni del computer hanno corroborato i nostri dati sperimentali: per BPA, DBP e TCS, l’algoritmo ha predetto reazioni di biotrasformazione di fase I e II, coerentemente con la riduzione dell’inibizione del NIS che abbiamo osservato. Anche per gli altri composti, le previsioni erano in linea con i nostri risultati in vitro.

Abbiamo anche confrontato i nostri dati con studi in vivo presenti in letteratura. Per BPA, DBP e TCS, è noto che vengono rapidamente metabolizzati ed escreti negli animali e nell’uomo. Per PCL e PFOS, è noto che sono resistenti al metabolismo. Per RSC, la situazione è più complessa: la letteratura riporta che viene metabolizzato, ma noi non abbiamo visto un effetto nel nostro saggio, forse a causa delle alte concentrazioni che abbiamo dovuto usare per vedere un’inibizione del NIS, che potrebbero aver “saturato” il sistema enzimatico, o perché i suoi metaboliti inibiscono il NIS quanto la molecola madre. Questo ci ricorda che l’inibizione del NIS potrebbe non essere il meccanismo d’azione primario per l’RSC, che agisce su altri bersagli tiroidei, come la tireoperossidasi (TPO), a concentrazioni molto più basse.

Uno Sguardo Oltre i Confini: La Rilevanza Inter-Specie

Un’altra domanda fondamentale è: quanto sono trasferibili i risultati ottenuti su cellule umane o di ratto ad altre specie? Per rispondere, abbiamo usato lo strumento SeqAPASS dell’EPA, che confronta le sequenze aminoacidiche delle proteine tra diverse specie. Abbiamo confrontato il NIS umano con quello di una vasta gamma di vertebrati. I risultati? Una elevata conservazione della sequenza, specialmente nei domini funzionali del NIS. Questo suggerisce che i risultati ottenuti con modelli basati sul NIS umano possono essere informativi anche per altri vertebrati, in particolare i mammiferi. Certo, questo vale soprattutto per una valutazione qualitativa (cioè se una sostanza è un inibitore o meno), mentre le previsioni quantitative sulla potenza di inibizione rimangono più incerte, specialmente per composti organici complessi che potrebbero agire su siti allosterici della proteina.

Conclusioni e Prospettive Future: Un Passo Avanti per la Scienza

In conclusione, il nostro studio dimostra che è possibile valutare l’inibizione del NIS da parte di potenziali interferenti tiroidei usando un saggio non radioattivo, accessibile e robusto. La reazione SK, abbinata a modelli cellulari ben caratterizzati come il nostro HEK293T NIS 02, offre risultati comparabili a quelli dei metodi tradizionali.

L’integrazione di un passaggio di biotrasformazione aumenta significativamente la rilevanza fisiologica del saggio, permettendoci di prevedere con maggiore accuratezza gli effetti in vivo delle sostanze chimiche. Abbiamo visto come il metabolismo possa mitigare gli effetti inibitori di alcuni composti, e questo è un passo avanti cruciale per una valutazione del rischio più realistica. Certo, ci sono ancora sfide, specialmente con i composti molto idrofobici, ma la strada è tracciata.

Questo tipo di ricerca non è importante solo per la tossicologia regolatoria e la protezione della salute umana e ambientale, ma ha anche implicazioni per le applicazioni mediche, dato il ruolo del NIS nella diagnosi e terapia dei tumori e dei disturbi tiroidei. La conservazione del NIS tra le specie rafforza ulteriormente la rilevanza dei nostri risultati.

Spero di avervi trasmesso un po’ dell’entusiasmo che c’è dietro a questo lavoro! Sviluppare metodi migliori per capire come le sostanze chimiche interagiscono con il nostro corpo è un tassello fondamentale per un futuro più sicuro e più sano. E noi continuiamo a lavorarci!

Fonte: Springer