NovaIscB: L’Ingegneria Proteica Guidata dall’Evoluzione che Riscrive il Futuro dell’Editing Epigenomico!

Ciao a tutti, appassionati di scienza e curiosi del futuro! Oggi voglio parlarvi di qualcosa che mi entusiasma da matti: come stiamo imparando a “dialogare” con il nostro genoma in modi sempre più sofisticati. Immaginate di avere degli strumenti molecolari talmente precisi e compatti da poter correggere non solo i geni, ma anche il modo in cui vengono “letti” e utilizzati dalle nostre cellule, e tutto questo direttamente dentro un organismo vivente! Sembra fantascienza, vero? Eppure, è proprio la frontiera su cui ci stiamo muovendo.

Alla Ricerca dell’Editor Perfetto: Oltre CRISPR-Cas9

Molti di voi avranno sentito parlare di CRISPR-Cas9, la superstar dell’editing genetico. È uno strumento pazzesco, non c’è dubbio, che ha rivoluzionato la biologia molecolare. Ma, come ogni tecnologia, ha i suoi limiti. A volte è un po’ “ingombrante” per essere trasportato facilmente nelle cellule, specialmente se vogliamo aggiungere altre funzionalità, come attivare o reprimere geni. E poi c’è sempre la sfida di essere super precisi, evitando modifiche indesiderate in altri punti del genoma.

Ecco perché la ricerca non si ferma mai! Noi scienziati siamo un po’ come degli esploratori, sempre alla ricerca di nuovi “continenti” nel vasto mondo della biologia. E in questa esplorazione, ci siamo imbattuti in una famiglia di enzimi chiamati OMEGA (Obligate Mobile Element Guided Activity), e in particolare in uno dei suoi membri più promettenti: IscB. Pensate, IscB è una sorta di “antenato” di Cas9, più piccolo e compatto. Una vera manna dal cielo se pensiamo alla necessità di “impacchettare” questi strumenti in vettori virali, come gli Adeno-Associated Viruses (AAV), che hanno una capacità di carico limitata.

Il problema? Le versioni naturali di IscB, pur essendo piccole, non erano proprio delle cime in termini di efficienza e specificità nel genoma umano. Ma noi non ci siamo persi d’animo. E se potessimo “allenare” IscB, guidati dalla sua stessa evoluzione e dalla conoscenza della sua struttura, per trasformarlo in un editor epigenomico di prim’ordine?

Nasce NovaIscB: Un Capolavoro di Ingegneria Proteica

Ed è qui che inizia la parte davvero avvincente della nostra storia. Abbiamo intrapreso un viaggio che definirei di “design proteico guidato dall’evoluzione”. Come funziona? Beh, è un mix affascinante di diverse strategie:

• Screening di Ortologhi: Per prima cosa, abbiamo setacciato la natura. Abbiamo cercato e testato tantissime varianti di IscB provenienti da organismi diversi (gli “ortologhi”) per trovare quella con le migliori caratteristiche di partenza per funzionare nelle cellule umane. Tra tutti, è emerso un candidato particolarmente interessante: OrufIscB.
• Ingegneria Strutturale e Dominio REC: OrufIscB era un buon inizio, ma volevamo di più. Studiando la struttura di IscB e confrontandola con quella di Cas9, ci siamo concentrati su una regione chiamata dominio REC (Recognition Lobe). In Cas9, questo dominio è cruciale per interagire con il DNA e l’RNA guida, garantendo specificità. Abbiamo pensato: e se inserissimo un dominio REC “su misura” in OrufIscB? Grazie a sofisticati modelli computazionali, come AlphaFold2 (che è un po’ come avere un GPS per navigare nel mondo tridimensionale delle proteine), abbiamo progettato e testato l’inserimento di vari domini REC. L’obiettivo era aumentare la “presa” della proteina sul DNA e migliorare la sua capacità di riconoscere la sequenza bersaglio, soprattutto con guide RNA più lunghe (che significano maggiore specificità).
• RNA Engineering: Non solo la proteina, ma anche l’RNA guida (chiamato ωRNA nel caso di IscB) è fondamentale. Abbiamo “sforbiciato” e ottimizzato l’ωRNA, rendendolo più corto e stabile, il che ne facilita la produzione e l’efficacia nelle cellule.
• Mutagenesi e “Loop Swapping”: Una volta inserito il dominio REC, abbiamo continuato a rifinire la proteina. Abbiamo introdotto mutazioni mirate e persino “scambiato” delle piccole anse flessibili (i “loop”) del dominio REC con quelle di altre proteine, sempre con l’idea di ottimizzare l’interazione con il DNA e l’RNA. È un po’ come mettere a punto un motore da corsa, cambiando piccoli pezzi qua e là per ottenere le massime prestazioni.

Dopo un lavoro immenso, testando oltre un migliaio di varianti (sì, avete letto bene!), siamo arrivati a NovaIscB. Questa nuova versione ingegnerizzata di IscB è una vera bomba: è compatta (solo 614 amminoacidi), fino a 100 volte più attiva della versione originale di OrufIscB nel genoma umano, e con una specificità notevolmente migliorata rispetto ad altri sistemi IscB ingegnerizzati. Usa in modo ottimale guide RNA di 20 nucleotidi, il che è ottimo per la precisione.

Abbiamo confrontato NovaIscB con altri editor compatti e persino con il “re” SpCas9. I risultati? NovaIscB mostra circa l’80% dell’attività di SpCas9 su siti comparabili, ma è significativamente più attiva e specifica di altri editor IscB ingegnerizzati e di altri sistemi compatti come AsCas12f-YHAM. Un bel passo avanti, no?

OMEGAoff: Silenziare i Geni con Precisione e Persistenza

Ma a cosa serve un super-editor se non lo mettiamo alla prova su un compito davvero importante? Qui entra in gioco l’epigenetica. L’epigenetica è quella branca della biologia che studia come l’espressione dei geni viene regolata senza alterare la sequenza del DNA stessa. Pensate a delle “etichette” chimiche che vengono apposte sul DNA, come la metilazione, che possono accendere o spegnere i geni.

Abbiamo quindi fuso la nostra NovaIscB (in una versione “inattivata” che non taglia il DNA, chiamata dNovaIscB) con degli enzimi capaci di scrivere queste etichette epigenetiche, in particolare delle metiltransferasi (Dnmt3A e Dnmt3L) e un dominio repressore trascrizionale (KRAB). Il risultato è un sistema che abbiamo battezzato OMEGAoff. La sua missione? Andare a bersagliare specifiche regioni regolatrici dei geni e “spegnerli” in modo duraturo inducendo la metilazione del DNA.

La cosa fantastica è che, grazie alle dimensioni ridotte di NovaIscB e dell’ωRNA ottimizzato, l’intero sistema OMEGAoff (proteina e RNA guida) può essere impacchettato in un singolo vettore AAV. Questo è un vantaggio enorme per le applicazioni in vivo, perché semplifica la somministrazione e aumenta l’efficienza con cui possiamo raggiungere le cellule bersaglio.

La Prova del Nove: OMEGAoff Contro il Colesterolo Alto

Per dimostrare la potenza di OMEGAoff in vivo, abbiamo scelto un bersaglio di grande rilevanza clinica: il gene PCSK9. Questo gene gioca un ruolo chiave nella regolazione dei livelli di colesterolo nel sangue. Spegnere PCSK9 nel fegato può portare a una significativa riduzione del colesterolo “cattivo”.

Abbiamo quindi caricato OMEGAoff (con dNovaIscB) su vettori AAV specifici per il fegato e li abbiamo somministrati a dei topi. E i risultati sono stati a dir poco entusiasmanti! Già dopo 3 settimane dall’iniezione, abbiamo osservato una significativa riduzione dei livelli della proteina PCSK9 nel siero dei topi trattati. E, cosa ancora più importante, questa riduzione si è mantenuta per l’intero periodo di osservazione di 6 mesi! Di conseguenza, anche i livelli di colesterolo totale nel siero sono diminuiti in modo significativo e persistente. Il tutto, senza apparenti segni di tossicità epatica.

Pensateci: siamo riusciti a ottenere una repressione genica mirata e duratura in vivo, utilizzando un sistema compatto veicolato da un singolo AAV, e senza indurre rotture nel DNA, il che è un enorme vantaggio in termini di sicurezza rispetto agli editor tradizionali che tagliano il DNA.

Un Futuro Ricco di Possibilità

Questo studio, secondo me, è una bellissima dimostrazione di come la combinazione di strategie diverse – dallo screening della diversità naturale all’ingegneria proteica guidata dalla struttura e dall’evoluzione, fino all’ingegneria dell’RNA – possa portare a strumenti molecolari potentissimi e altamente ottimizzati.

NovaIscB e OMEGAoff aprono la strada a tantissime applicazioni, non solo per la ricerca di base, ma anche per lo sviluppo di nuove terapie per malattie genetiche e complesse. La possibilità di modulare l’espressione genica in modo persistente e sicuro in vivo è un sogno che si avvicina sempre di più alla realtà.

Certo, c’è ancora strada da fare. Ad esempio, stiamo lavorando per espandere ulteriormente la versatilità di NovaIscB, magari rendendola capace di riconoscere sequenze TAM (Target Adjacent Motif, piccole sequenze vicine al sito bersaglio che l’enzima deve riconoscere) più variegate, o fondendola con altri domini funzionali per applicazioni come il base editing o il prime editing, sempre mantenendo il vantaggio delle dimensioni ridotte per la veicolazione con AAV.

Quello che mi porto a casa da questa avventura scientifica è che la natura è una fonte inesauribile di ispirazione, e che la nostra capacità di “dialogare” con essa attraverso l’ingegneria ci permette di sbloccare potenzialità incredibili. Il futuro dell’editing genomico ed epigenomico è più brillante (e compatto!) che mai, e non vedo l’ora di scoprire cosa ci riserveranno i prossimi capitoli di questa entusiasmante storia!

Fonte: Springer Nature