Macrofagi Sotto Scacco: Come NF-κB Sopprime l’Autofagia Indotta da Piocianina

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi nel cuore pulsante della cellula, in particolare nei nostri guardiani del sistema immunitario: i macrofagi. Parleremo di una battaglia microscopica affascinante, dove un batterio astuto, *Pseudomonas aeruginosa*, cerca di farsi strada, e di come le nostre cellule rispondono… a volte in modi sorprendentemente complessi.

Il Nemico: Pseudomonas aeruginosa e la Piocianina (PYO)

Avete mai sentito parlare di *Pseudomonas aeruginosa* (PA)? È un batterio Gram-negativo, un vero opportunista, spesso responsabile di quelle fastidiose infezioni ospedaliere, specialmente quelle resistenti agli antibiotici. L’OMS lo ha classificato come “critico”, il che significa che abbiamo un disperato bisogno di nuove armi per combatterlo.

Uno dei suoi assi nella manica è una tossina chiamata piocianina (PYO). Questa molecola bluastra non è solo un colorante, ma un vero e proprio sabotatore cellulare. Interferisce con il trasporto di elettroni, la respirazione, il metabolismo energetico e persino con l’espressione genica e le risposte immunitarie innate delle cellule ospiti. Insomma, un vero piantagrane.

Autofagia: Pulizia Cellulare Sotto Attacco

Le nostre cellule, di fronte a stress o invasioni, hanno un meccanismo di difesa e pulizia interna chiamato autofagia. Immaginatelo come un sistema di riciclaggio super efficiente: la cellula impacchetta componenti danneggiati o indesiderati (come batteri invasori) in vescicole chiamate autofagosomi, per poi degradarli.

Studi precedenti, inclusi i nostri, avevano già mostrato che la PYO può indurre l’autofagia in diversi tipi di cellule, compresi i macrofagi. Anche in questo studio, abbiamo confermato che trattando macrofagi umani (derivati dalla linea cellulare THP-1) con PYO, osserviamo un aumento di un marcatore chiave dell’autofagia, la proteina LC3B II, e la formazione di più autofagosomi. Abbiamo persino usato la clorochina (CQ), che blocca la fase finale dell’autofagia, per dimostrare che la PYO non solo avvia il processo, ma ne aumenta l’intero flusso. Quindi, sì, la PYO spinge i macrofagi a “fare pulizia”.

Il Freno Nascosto: Entra in Gioco l’Epigenetica (H3K27me3)

Ma qui la storia si complica. La regolazione dei geni non è solo una questione di accensione/spegnimento. C’è un livello di controllo più sottile, chiamato epigenetica, che coinvolge modifiche chimiche al DNA e alle proteine che lo impacchettano (gli istoni). Una di queste modifiche è la trimetilazione della lisina 27 sull’istone H3, nota come H3K27me3. Generalmente, questo “marchio” epigenetico agisce come un segnale di “silenzio”, reprimendo la trascrizione dei geni.

Nel nostro lavoro precedente, avevamo visto che un’altra modifica sullo stesso sito, l’acetilazione (H3K27ac), *promuoveva* l’autofagia indotta da PYO. Ci siamo quindi chiesti: cosa fa la metilazione (H3K27me3) in questo contesto?

Sorprendentemente, abbiamo scoperto che la PYO non solo induce l’autofagia, ma aumenta anche i livelli di H3K27me3 nei macrofagi THP-1! Come? Principalmente aumentando l’espressione di un enzima chiamato EZH2, la “macchina” che appone il marchio H3K27me3. L’enzima che lo rimuove (JMJD3) non sembrava essere influenzato.

Se H3K27me3 è un segnale di silenzio, e i suoi livelli aumentano con la PYO, cosa significa per l’autofagia? Abbiamo usato degli inibitori specifici di EZH2 (EI1 e CPI-169) per scoprirlo. Bloccando EZH2, abbiamo ridotto i livelli di H3K27me3 e… voilà! L’autofagia (misurata tramite LC3B II e autofagosomi) è aumentata ancora di più rispetto al trattamento con la sola PYO.

Questo ci dice una cosa fondamentale: H3K27me3, potenziato da PYO tramite EZH2, agisce come un *freno* sull’autofagia stessa che la PYO aveva inizialmente stimolato. Un meccanismo di controllo interno, forse?

Spegnere i Motori dell’Autofagia: ULK1 e MAP1LC3B

Ma come fa H3K27me3 a frenare l’autofagia? Agisce sui geni chiave del processo. Abbiamo analizzato la trascrizione di alcuni geni fondamentali per l’autofagia: ULK1, BECN1 e MAP1LC3B (il gene che produce LC3B).
La PYO aumentava l’espressione di tutti e tre. Tuttavia, quando abbiamo aggiunto gli inibitori di EZH2 (riducendo quindi H3K27me3), l’espressione di ULK1 e MAP1LC3B è schizzata ancora più in alto, mentre quella di BECN1 è rimasta invariata.

Usando una tecnica chiamata ChIP-qPCR, che ci permette di vedere dove specifiche proteine si legano al DNA, abbiamo confermato che il marchio H3K27me3 si legava meno ai promotori (le regioni di accensione) dei geni ULK1 e MAP1LC3B quando le cellule erano trattate con PYO (il che spiega perché la loro trascrizione aumentava). Ma quando abbiamo inibito EZH2, il legame di H3K27me3 si è ridotto ulteriormente, permettendo una trascrizione ancora maggiore.

In sintesi: H3K27me3 reprime specificamente la trascrizione di ULK1 e MAP1LC3B. La PYO, pur aumentando i livelli generali di H3K27me3, sembra ridurne il reclutamento su questi specifici geni (forse per un effetto iniziale pro-autofagico), ma l’aumento complessivo di H3K27me3 mediato da EZH2 agisce comunque da freno generale.

Il Regista Occulto: NF-κB Entra in Scena

C’è un altro attore chiave in questa storia: NF-κB. È un fattore di trascrizione pro-infiammatorio, un vero “regista” cellulare che, una volta attivato, si sposta nel nucleo e orchestra la risposta a vari stimoli, inclusi quelli batterici. Sapevamo che NF-κB può influenzare i livelli di H3K27me3 e che il suo ruolo nell’autofagia è complesso, a volte attivandola, a volte reprimendola.

Cosa fa NF-κB nel nostro scenario con la PYO? Abbiamo scoperto che la PYO non cambia i livelli totali di NF-κB, ma ne aumenta la forma attiva (fosforilata) e, soprattutto, ne promuove la traslocazione nel nucleo, il centro di comando della cellula.

E qui arriva il bello: usando la co-immunoprecipitazione (una tecnica per vedere quali proteine interagiscono tra loro), abbiamo trovato che nel nucleo, NF-κB interagisce *maggiormente* con H3K27me3 dopo il trattamento con PYO. Sembra che lavorino insieme!

Per capire il ruolo di NF-κB sull’autofagia, abbiamo usato la curcumina, una sostanza nota per inibire la traslocazione nucleare di NF-κB. Trattando le cellule con PYO e curcumina, abbiamo visto meno NF-κB nel nucleo e, di conseguenza, un *aumento* dell’autofagia (più LC3B II).

Inoltre, la ChIP-qPCR ha rivelato che NF-κB si lega ai promotori di ULK1 e MAP1LC3B, e questo legame diminuisce quando blocchiamo la sua entrata nel nucleo con la curcumina. Questo suggerisce che NF-κB, una volta nel nucleo, contribuisce a *reprimere* questi geni dell’autofagia.

La Catena di Comando: Da NF-κB a H3K27me3

Abbiamo quindi un quadro più chiaro: sia H3K27me3 che NF-κB sembrano frenare l’autofagia indotta da PYO, reprimendo geni come ULK1 e MAP1LC3B, e interagiscono pure tra loro. Ma chi comanda chi?

Abbiamo verificato se H3K27me3 potesse regolare NF-κB. Inibendo EZH2 (e quindi riducendo H3K27me3), non abbiamo visto cambiamenti nella trascrizione del gene di NF-κB (NFKB1) né nel legame di H3K27me3 al suo promotore. Quindi, sembra che H3K27me3 non controlli NF-κB in questo contesto.

E il contrario? NF-κB regola H3K27me3? Assolutamente sì! Quando abbiamo bloccato NF-κB con la curcumina, abbiamo osservato una *riduzione* della trascrizione del gene EZH2 (la macchina che produce H3K27me3), che invece era aumentata con la sola PYO. La ChIP-qPCR ha confermato che NF-κB si lega direttamente al promotore di EZH2, attivandone la trascrizione. Di conseguenza, bloccando NF-κB, abbiamo visto anche una diminuzione dei livelli delle proteine EZH2 e H3K27me3.

Ecco svelata la catena di comando:

1. La PYO attiva NF-κB e lo fa entrare nel nucleo.
2. Nel nucleo, NF-κB fa due cose principali:
   • Attiva la trascrizione del gene EZH2.
   • Si lega (probabilmente in collaborazione con l’aumentato H3K27me3 prodotto da EZH2) ai promotori dei geni dell’autofagia ULK1 e MAP1LC3B, reprimendoli.
3. L’aumento di EZH2 porta a più H3K27me3, che rafforza la repressione dei geni bersaglio e agisce come freno generale sull’autofagia.

Perché è Importante? Implicazioni e Prospettive

Questa scoperta dell’asse NF-κB/EZH2/H3K27me3 come freno dell’autofagia indotta da PYO nei macrofagi è cruciale. L’autofagia è un’arma a doppio taglio nelle infezioni: può aiutare a eliminare i batteri, ma alcuni patogeni possono sfruttarla o manipolarla per sopravvivere.

Il fatto che la PYO induca l’autofagia ma attivi contemporaneamente un meccanismo per reprimerla suggerisce una complessa interazione ospite-patogeno. Potrebbe essere una strategia del batterio per limitare una risposta difensiva eccessiva? O un meccanismo di autoregolazione della cellula ospite per evitare danni da un’autofagia troppo spinta?

Capire questi meccanismi molecolari fini è fondamentale. Potremmo, in futuro, pensare a strategie terapeutiche che modulino questa via di segnalazione per potenziare la capacità dei macrofagi di eliminare *Pseudomonas aeruginosa*, specialmente nelle infezioni difficili da trattare. Agire su EZH2 o NF-κB potrebbe diventare un modo per “rilasciare il freno” dell’autofagia e aiutare il nostro sistema immunitario a combattere meglio questo patogeno critico.

Insomma, la battaglia all’interno delle nostre cellule è incredibilmente sofisticata, piena di segnali, contro-segnali e regolazioni finissime. Continuare a esplorarla è la chiave per trovare nuove soluzioni contro le infezioni batteriche.

Fonte: Springer