Nanopore e Sepsi: La Mia Caccia ai Segreti dell’RNA per Biomarcatori del Futuro!

Amici della scienza e curiosi di ogni sorta, mettetevi comodi perché oggi vi porto con me in un viaggio affascinante nel mondo infinitesimamente piccolo dell’RNA, alla scoperta di come una tecnologia pazzesca, chiamata sequenziamento diretto dell’RNA con Nanopore, stia aprendo orizzonti impensabili nella lotta contro un nemico subdolo e pericoloso: la sepsi.

Immaginate di poter “leggere” direttamente le istruzioni che le nostre cellule usano per funzionare, l’RNA appunto, e di farlo in tempo reale, quasi come spiare una conversazione segretissima. Beh, è un po’ quello che stiamo cercando di fare, e vi assicuro che le implicazioni sono da capogiro, specialmente quando si tratta di malattie complesse come la sepsi, dove ogni minuto conta.

Cos’è questa Sepsi e Perché Dovrebbe Interessarci?

Prima di tuffarci nei tecnicismi, due parole sulla sepsi. Non è una malattia specifica, ma una risposta esagerata e potenzialmente letale del nostro corpo a un’infezione. In pratica, il sistema immunitario, nel tentativo di combattere batteri o virus, finisce per danneggiare i tessuti e gli organi del corpo stesso. Capire rapidamente se un paziente ha la sepsi, e se è di origine batterica o virale, è cruciale per scegliere la terapia giusta. Ed è qui che entriamo in gioco noi, o meglio, la nostra capacità di analizzare il trascrittoma.

Il Vecchio e il Nuovo: Illumina vs. Nanopore

Per anni, per studiare l’RNA e capire quali geni fossero “accesi” o “spenti” in una malattia, ci siamo affidati principalmente al sequenziamento short-read, tipo quello della piattaforma Illumina. Funziona bene, per carità: ci dà dati accurati e una buona copertura. Però, ha i suoi limiti. Immaginate di dover ricostruire un libro intero avendo a disposizione solo frasi spezzettate: è un po’ così. Questo metodo prevede la conversione dell’RNA in DNA complementare (cDNA) e la sua amplificazione, passaggi che possono introdurre errori o “bias”. Inoltre, le “letture corte” rendono difficile distinguere tra diverse versioni dello stesso gene (le isoforme) o misurare dettagli come la lunghezza della coda poli(A) – una specie di etichetta che influenza la vita e l’attività dell’RNA.

Ed ecco che arriva il supereroe della situazione: il sequenziamento diretto dell’RNA con Nanopore (ONT). Questa tecnologia è una vera figata! Permette di analizzare le molecole di RNA native, così come sono, senza convertirle o amplificarle troppo. E soprattutto, legge sequenze lunghissime! Questo ci apre un mondo di informazioni prima inaccessibili: possiamo vedere le isoforme complete, misurare con precisione la lunghezza delle code poli(A) e, potenzialmente, scovare modificazioni chimiche sull’RNA stesso. È come passare da frasi smozzicate a capitoli interi del nostro libro genetico!

Il Nostro Studio: Nanopore alla Prova del Sangue (di Pazienti con Sepsi)

Nel nostro studio, abbiamo preso campioni di sangue da 12 pazienti pediatrici con sepsi (6 con infezione batterica confermata e 6 con infezione virale confermata) e abbiamo analizzato l’mRNA con la tecnologia Nanopore. Poi, abbiamo confrontato questi dati con quelli ottenuti dagli stessi campioni usando il metodo Illumina, che avevamo già da uno studio precedente più ampio. L’obiettivo? Capire se i due metodi “parlano la stessa lingua” in termini di conteggio genico e, soprattutto, quali informazioni extra ci regala il Nanopore.

La prima buona notizia è che, scegliendo attentamente i software di analisi (NanoCount per Nanopore e Kallisto per Illumina), la correlazione tra i conteggi genici dei due sistemi è risultata molto alta, con un coefficiente di Pearson medio di 0.927 a livello di gene e 0.736 a livello di isoforma. Questo ci dice che entrambe le piattaforme sono valide per scoprire e validare biomarcatori basati sull’espressione genica. È un po’ come avere due traduttori affidabili per la stessa lingua antica: magari usano parole leggermente diverse, ma il significato generale è lo stesso.

Certo, qualche differenza c’è. Abbiamo notato, ad esempio, che il Nanopore, con la metrica TPM (Transcripts Per Million) non normalizzata per la lunghezza, tende a “preferire” i geni più corti, mentre Illumina con Kallisto gestisce meglio questo aspetto. Anche il contenuto di GC (guanina-citosina) sembra influenzare un po’ entrambi. Sono dettagli tecnici, ma importanti per chi fa il nostro mestiere e cerca la massima precisione.

Le Meraviglie Nascoste Svelate dal Nanopore

Ma il bello del Nanopore, come vi dicevo, è quello che ci mostra oltre il semplice conteggio dei geni. E qui, ragazzi, si apre un vero tesoro!

• Le Code Poli(A) Parlano: Queste code, attaccate alla fine di molte molecole di mRNA, sono fondamentali per la loro stabilità e per l’efficienza con cui vengono tradotte in proteine. Con il Nanopore, possiamo misurarne la lunghezza. Abbiamo visto che i trascritti mitocondriali hanno code poli(A) più corte (intorno ai 45 nucleotidi) rispetto a quelli nucleari (picco intorno agli 80 nucleotidi, ma con alcune che superano i 350!). Ma la cosa più intrigante è che, analizzando i geni in base alla lunghezza della loro coda poli(A), abbiamo scoperto dei pattern. Geni coinvolti nella produzione di energia e nella sintesi proteica tendono ad avere code più corte. Questo potrebbe significare che sono RNA “usa e getta” rapido, o, secondo scoperte recenti, che sono trascritti molto abbondanti e tradotti efficientemente. Al contrario, geni legati alla segnalazione cellulare, alla risposta immunitaria e alla regolazione trascrizionale mostrano code poli(A) più lunghe, forse per garantire una produzione proteica più robusta e duratura. Pensateci: è come se il nostro corpo usasse etichette di diversa lunghezza per dire “questo messaggio è urgente e breve” oppure “questo è importante e deve durare”.
• Caccia alle Isoforme Sconosciute: Grazie alle letture lunghe, abbiamo identificato ben 240 nuove isoforme trascrizionali che non erano artefatti! Molte di queste erano “Combinazioni di Giunzioni Note”, il che significa che usano pezzi di geni già conosciuti in modi nuovi. È come scoprire che con gli stessi mattoncini Lego si possono costruire forme completamente inedite. Ogni nuova isoforma potrebbe avere una funzione diversa e rappresentare un nuovo tassello per capire la malattia.

Biomarcatori Specifici per la Sepsi: Cosa Abbiamo Trovato?

Ok, tutto molto bello, ma cosa ci dice questo sulla sepsi batterica rispetto a quella virale? Qui le cose si fanno specifiche:

• Geni Espressi Diversamente (DEGs): Abbiamo trovato 9 geni la cui espressione era significativamente diversa tra infezioni batteriche e virali. Otto erano più espressi nei pazienti con infezione virale, e uno in quelli con infezione batterica. E la cosa super confortante è che questi risultati erano coerenti con quelli ottenuti con Illumina nello studio più grande!
• Geni con Poladenilazione Differenziale (DPGs): Qui la faccenda si fa ancora più interessante. Abbiamo identificato inizialmente 19 geni le cui code poli(A) avevano lunghezze diverse tra i due tipi di infezione. Dopo un’analisi di sensibilità più stringente, due geni sono emersi come robustamente differenziali: TPM4 e PIP4K2A. Questo suggerisce che la regolazione della lunghezza della coda poli(A) potrebbe essere un meccanismo importante nella risposta alla sepsi e una nuova fonte di biomarcatori.
• Uso Differenziale dei Trascritti (DTU): Non solo quanto un gene è espresso, ma quale versione (isoforma) di quel gene è usata di più. Abbiamo trovato quattro geni (SOD2, RPS21, CD36, RPL37) che mostravano un uso diverso delle loro isoforme tra sepsi batterica e virale. Per esempio, per il gene SOD2, un’isoforma era meno usata nelle infezioni virali, mentre un’altra era più usata. SOD2 è un regolatore critico della segnalazione antivirale, mentre CD36 è coinvolto nelle risposte infiammatorie. Questi dettagli, invisibili con le sole letture corte, potrebbero essere cruciali.

Perché Tutto Questo Entusiasmo? I Vantaggi del Nanopore

Ricapitolando, il sequenziamento diretto dell’RNA con Nanopore è una bomba perché:

1. È veloce, quasi in tempo reale.
2. Analizza l’RNA direttamente, eliminando i bias della conversione in cDNA.
3. Legge sequenze lunghissime, identificando isoforme e varianti di splicing.
4. Permette di misurare la lunghezza completa delle code poli(A).

Certo, non è tutto oro quello che luccica. Il Nanopore ha ancora una capacità produttiva (throughput) inferiore rispetto a Illumina, richiede più RNA in ingresso (anche se i protocolli stanno migliorando), e i software di analisi sono più giovani e in continua evoluzione. Nel nostro piccolo studio, con solo 12 campioni, i risultati statistici su DEGs e DPGs sono promettenti ma necessitano di conferme su coorti più ampie.

Cosa ci Riserva il Futuro?

Io sono convinto che siamo solo all’inizio. Il Nanopore ci sta aprendo una finestra sulla biologia dell’RNA che era impensabile fino a pochi anni fa. Oltre alla lunghezza delle code poli(A) e alle isoforme, c’è tutto il mondo delle modificazioni dell’RNA (l’epitrascrittomica!) che aspetta di essere esplorato come fonte di biomarcatori. Immaginate di poter avere, da una singola analisi del sangue, non solo l’identità del patogeno, ma anche una stima precisa della gravità della sepsi e della risposta individuale del paziente, grazie a questi biomarcatori co- e post-trascrizionali.

Il nostro studio, seppur preliminare, dimostra che il sequenziamento Nanopore non solo regge il confronto con le tecnologie consolidate per le analisi di espressione genica, ma offre un livello di dettaglio sulla regolazione dell’RNA che è semplicemente straordinario. Per la prima volta, a quanto ne so, abbiamo visualizzato la distribuzione della lunghezza delle code poli(A) specifica per pathway molecolari nel sangue umano. Questo, amici miei, è il tipo di progresso che può davvero cambiare le carte in tavola nella diagnosi e, speriamo un giorno, nel trattamento di malattie complesse come la sepsi.

La strada è ancora lunga, servono più studi, più campioni, e un continuo affinamento delle tecniche e degli strumenti di analisi. Ma la promessa di poter decifrare i messaggi più reconditi del nostro RNA per combattere le malattie è troppo eccitante per non essere perseguita con tutte le nostre forze. E io, nel mio piccolo, sono entusiasta di far parte di questa avventura!

Fonte: Springer