Nanocorpi su Misura per Colpire il Cancro: La Sfida Vinta della Mesotelina

Ciao a tutti! Oggi voglio raccontarvi una storia affascinante che arriva direttamente dal fronte della ricerca contro il cancro, un campo dove ogni piccolo passo avanti può fare una differenza enorme. Parliamo di “teranostica”, una parola un po’ complessa che unisce due concetti potentissimi: terapia e diagnostica. Immaginate di avere uno strumento che non solo ci permette di “vedere” il tumore con precisione incredibile, ma che può anche essere armato per distruggerlo selettivamente. Fantastico, vero?

Il Nostro Bersaglio: La Mesotelina

Al centro della nostra ricerca c’è una proteina chiamata mesotelina. Normalmente se ne sta tranquilla sulle cellule mesoteliali (quelle che rivestono alcuni organi interni), ma in diversi tipi di cancro, come il tumore al seno triplo negativo (TNBC) o quello pancreatico, la sua espressione va alle stelle. Questo la rende un bersaglio ideale: colpire lei significa colpire il tumore, lasciando in pace le cellule sane.

Gli Eroi in Miniatura: i Nanocorpi (sdAb)

Per dare la caccia alla mesotelina, usiamo degli agenti speciali: i nanocorpi, noti anche come sdAb (single-domain antibodies). Pensateli come versioni “minimaliste” degli anticorpi tradizionali, derivati da quelli un po’ particolari che si trovano nei camelidi (sì, cammelli e lama!). Questi nanocorpi sono piccoli, agili, super specifici nel riconoscere il loro bersaglio e vengono eliminati rapidamente dal corpo, tranne dove si legano al tumore. Questo permette di ottenere immagini diagnostiche nitide (come quelle PET) in tempi brevi, con un ottimo contrasto tra tumore e tessuti sani. Noi avevamo già lavorato con un nanocorpo anti-mesotelina chiamato A1, dimostrando che funziona bene per l’imaging SPECT.

Il Problema della Marcatura Casuale

Per rendere visibili questi nanocorpi nelle scansioni PET o per armarli con isotopi radioattivi terapeutici, dobbiamo attaccarci un “gancio” chimico, un chelante come il DOTA, a cui poi legheremo l’isotopo radioattivo (ad esempio, il Gallio-68 per la PET o il Lutezio-177 per la terapia). Il metodo standard è legare il DOTA agli amminoacidi di lisina presenti sulla superficie del nanocorpo. Il problema? Di solito ci sono diverse lisine (nel nostro A1 ce ne sono quattro conservate in posizioni specifiche). Attaccare il DOTA in questo modo è come lanciare della vernice a caso su un muro sperando di colpire solo certi punti: il risultato è un miscuglio di nanocorpi con un numero variabile di molecole DOTA attaccate in posizioni diverse. Questa eterogeneità non è ideale, perché molecole diverse possono comportarsi in modo leggermente diverso nel corpo, influenzando la precisione diagnostica e l’efficacia terapeutica.

La Nostra Idea: Ingegneria Molecolare Mirata

E se potessimo dire esattamente dove attaccare il DOTA? Se potessimo avere un solo punto di aggancio per nanocorpo, sempre nello stesso posto? Qui entra in gioco l’ingegneria molecolare. Abbiamo pensato: perché non modificare geneticamente il nostro nanocorpo A1 per eliminare tre delle quattro lisine “standard”, sostituendole con un altro amminoacido simile (l’arginina), e lasciarne solo una disponibile per l’aggancio del DOTA?

Detto, fatto! Abbiamo creato quattro versioni mutanti del nostro A1 (chiamiamole A1K1, A1K2, A1K3 e A1K4), ognuna con una sola lisina superstite in una delle quattro posizioni originali. L’idea era semplice ma potente: ottenere un prodotto finale omogeneo, dove ogni nanocorpo ha esattamente un DOTA attaccato sempre nello stesso punto. Questo processo, tra l’altro, è molto più diretto rispetto ad altre tecniche di marcatura sito-specifica come l’approccio “sortase”, che richiede enzimi e passaggi aggiuntivi.

Mettiamo alla Prova i Mutanti

Abbiamo prodotto questi quattro mutanti e verificato alcune cose fondamentali:

• Affinità: Si legano ancora bene alla mesotelina? Sì! Le analisi (SPR) hanno mostrato che l’affinità era praticamente identica all’originale A1. Le nostre modifiche non avevano rovinato la capacità di riconoscere il bersaglio. Questo era in linea con le previsioni fatte al computer (usando AlphaFold v3), che indicavano che le lisine non erano cruciali per il legame.
• Stabilità: Resistono al calore necessario per attaccare il Gallio-68? Sì, abbiamo visto (con dicroismo circolare) che potevamo scaldarli a 60°C senza problemi strutturali.
• Marcatura: Siamo riusciti ad attaccare il DOTA in modo specifico? Assolutamente! Abbiamo ottimizzato le condizioni e ottenuto nanocorpi con, in media, meno di un DOTA per molecola (come ci aspettavamo, avendo un solo sito). Curiosamente, A1K1 ha mostrato un’efficienza di coniugazione leggermente inferiore rispetto agli altri.
• Radiomarcatura e Stabilità Radiochimica: Siamo riusciti ad attaccare il ⁶⁸Ga in modo efficiente e stabile? Sì, tutti i mutanti si sono radiomarcati bene (>91% di purezza iniziale). Tuttavia, A1K3 ha mostrato una stabilità un po’ inferiore dopo 2 ore.

I Test Decisivi: In Vivo nei Topi

La vera prova del nove, però, è vedere come si comportano questi nanocorpi modificati in un organismo vivente. Abbiamo iniettato i nostri ⁶⁸Ga-DOTA-A1 mutanti in topi con tumori umani (linea cellulare HCC70, che esprime mesotelina) e abbiamo usato la PET/CT per vedere dove andavano a finire.

Come previsto per i nanocorpi, l’accumulo maggiore non specifico si è visto nei reni, la principale via di eliminazione. L’accumulo nel tumore era buono per tutti, ma abbiamo notato delle differenze:

• ⁶⁸Ga-DOTA-A1K1: Mostrava un accumulo un po’ più alto nel fegato e nella milza rispetto agli altri, portando a rapporti tumore/fegato e tumore/sangue meno favorevoli. Non ideale.
• ⁶⁸Ga-DOTA-A1K3: Già sapevamo che era meno stabile radiochimicamente. Meno interessante.
• ⁶⁸Ga-DOTA-A1K2 e ⁶⁸Ga-DOTA-A1K4: Questi due sembravano i più promettenti, con un buon accumulo nel tumore e profili di biodistribuzione simili all’originale A1 (ma ora con il vantaggio della marcatura sito-specifica!).

Ottimizzazione: Ridurre l’Accumulo nei Reni

L’accumulo nei reni è un classico “tallone d’Achille” per i nanocorpi, specialmente se si pensa alla terapia (non vogliamo irradiare troppo i reni!). Sapevamo da studi precedenti che ci sono dei trucchi per ridurlo. Uno è rimuovere il “tag” di istidine (His-tag) che usiamo per purificare le proteine in laboratorio. Un altro è co-iniettare una sostanza chiamata Gelofusin, che compete per il riassorbimento nei reni.

Abbiamo quindi prodotto A1K2 e A1K4 senza His-tag e abbiamo provato a combinarlo con l’iniezione di Gelofusin. I risultati sono stati notevoli! Rimuovere l’His-tag da solo ha ridotto l’accumulo renale e, interessante, anche quello nel fegato e nella milza. Combinare la rimozione dell’His-tag con Gelofusin ha abbattuto l’accumulo renale fino all’86% rispetto alla versione originale con His-tag, senza influenzare negativamente l’accumulo nel tumore! Questo ha migliorato enormemente il rapporto tumore/rene.

Il Vincitore: A1K2 si Distingue

Mettendo a confronto diretto i due finalisti (A1K2 e A1K4, entrambi senza His-tag e con Gelofusin), abbiamo scoperto una differenza cruciale. Sebbene l’accumulo nel tumore fosse simile, ⁶⁸Ga-DOTA-A1K2 mostrava un accumulo nei reni significativamente più basso (quasi il 60% in meno!) rispetto a ⁶⁸Ga-DOTA-A1K4. Questo si è tradotto in un rapporto tumore/rene più che doppio per A1K2, e anche il rapporto tumore/fegato era migliore.

Questo rende A1K2 il nostro candidato principale per l’imaging dei tumori che esprimono mesotelina, con un accumulo minimo negli organi non bersaglio. È la versione più “pulita” e precisa che abbiamo ottenuto.

Perché è Importante e Cosa Succede Ora?

Per la prima volta, abbiamo dimostrato che è possibile ottenere una marcatura DOTA sito-specifica su nanocorpi usando un approccio semplice basato sulla mutazione di lisine, evitando la produzione di miscele eterogenee. Questo non solo migliora la qualità del nostro agente diagnostico/terapeutico, ma semplifica anche la produzione e potenzialmente il percorso verso l’uso clinico.

Abbiamo visto che la posizione della singola lisina rimasta conta! A1K2 si è rivelato il migliore in termini di biodistribuzione, minimizzando l’esposizione di organi sani come i reni. Questo è fondamentale se vogliamo passare alla fase successiva: usare questo nanocorpo per la terapia. Stiamo già pianificando studi per valutare l’efficacia terapeutica di ¹⁷⁷Lu-DOTA-A1K2, dove il Lutezio-177 rilascerà radiazioni beta direttamente sulle cellule tumorali.

Il bello è che le quattro posizioni delle lisine che abbiamo studiato sono molto conservate in tantissimi altri nanocorpi. Questo significa che la nostra strategia di ingegnerizzazione e selezione del “sito K migliore” potrebbe essere applicata ad ampio raggio per sviluppare nuovi e migliori agenti teranostici basati su nanocorpi per diverse malattie. È un passo avanti entusiasmante nella creazione di farmaci sempre più intelligenti e precisi!

Fonte: Springer