MuSK e CaMK2β: Un Legame Possibile, Ma Non Indispensabile In Vivo!

Ciao a tutti, appassionati di scienza e curiosi dei misteri del nostro corpo! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel mondo microscopico dei nostri muscoli, precisamente alla giunzione neuromuscolare (GNM). Pensateci: è quel punto d’incontro incredibilmente preciso e vitale tra i nervi motori e le fibre muscolari, il “ponte di comando” che permette ai nostri muscoli di contrarsi e a noi di muoverci, correre, saltare… vivere!

Il Regista Occulto: MuSK

Al centro di questo meccanismo c’è una proteina che fa da vero e proprio regista: la chinasi muscolo-specifica, che chiameremo amichevolmente MuSK. È lei che orchestra la formazione e il mantenimento di questa giunzione, assicurandosi che tutto funzioni a dovere per tutta la vita. Uno dei suoi compiti principali è quello di far “raggruppare” i recettori per l’acetilcolina (AChR) proprio lì, nel punto giusto della membrana muscolare (la postsinapsi).

Come fa MuSK a sapere quando e dove attivarsi? Principalmente attraverso un processo chiamato autofosforilazione. Immaginate delle piccole “etichette” chimiche (gruppi fosfato) che MuSK attacca a sé stessa su specifici residui di tirosina. Questo “accende” la sua attività enzimatica. È un meccanismo finemente regolato: senza il segnale giusto (come la proteina Agrina, rilasciata dal nervo motore, che si lega al co-recettore Lrp4), MuSK rimane “spenta”.

Un Nuovo Indizio: La Fosforilazione della Serina S751

Qualche tempo fa, noi e altri gruppi di ricerca avevamo notato qualcosa di interessante: oltre alle tirosine, MuSK poteva essere fosforilata anche su un residuo di serina, in particolare nella posizione S751, proprio nel suo “cuore” attivatore (il loop di attivazione). Questa fosforilazione avveniva dopo quella delle tirosine e sembrava avere un ruolo nel modulare l’attività di MuSK, specialmente quando i segnali di attivazione (come l’Agrina) erano deboli. Poteva essere importante nelle prime fasi dello sviluppo o durante l’invecchiamento? La domanda era aperta. Ma chi era il “pittore” che aggiungeva questo gruppo fosfato sulla serina S751? I soliti sospetti (PKA, PKC, MAPK, etc.) erano stati esclusi. Dovevamo trovare il colpevole!

La Caccia alla Chinasi: Entra in Scena CaMK2β

Per scovare la chinasi responsabile, abbiamo messo in piedi un’indagine degna di un detective molecolare. Abbiamo usato un saggio *in vitro* che ha testato ben 245 diverse chinasi Serina/Treonina (S/T) del “kinoma” umano (l’insieme di tutte le chinasi). Abbiamo preparato dei piccoli “bersagli”: peptidi che mimavano la regione di MuSK attorno a S751, sia nella versione normale sia in quella già fosforilata sulle tirosine (perché sapevamo che la fosforilazione della serina avveniva dopo). Ebbene, il risultato è stato netto: solo tre chinasi hanno mostrato una significativa capacità di fosforilare i nostri peptidi target: CaMK2α, CaMK2β e CaMK2δ. Tra queste, CaMK2β spiccava per la sua efficienza, soprattutto quando i peptidi erano già fosforilati sulle tirosine (attività aumentata di 8.5 volte!). Bingo! La sequenza attorno a S751, inoltre, corrispondeva perfettamente al “motivo” di riconoscimento preferito dalla famiglia CaMK2, come confermato da studi recenti sulla struttura di CaMK2β legata ai suoi substrati. Sembrava proprio che avessimo trovato il nostro candidato principale: la proteina chinasi II calcio/calmodulina-dipendente beta (CaMK2β).

Conferme… e Prime Sorprese

Per essere sicuri, siamo passati dalle provette alle cellule. Abbiamo fatto esprimere MuSK insieme a diverse versioni di CaMK2β (normale, sempre attiva – KA, e inattiva – KD) in cellule non muscolari (HEK293T). I risultati hanno confermato i dati *in vitro*: quando CaMK2β era nella sua forma super-attiva (KA), la fosforilazione di MuSK, sia sulle tirosine che sulla serina S751, aumentava notevolmente! Questo suggeriva che CaMK2β potesse davvero “potenziare” l’attivazione di MuSK.

Ma la biologia ama le sorprese. CaMK2β è presente anche nelle cellule muscolari, e noi l’abbiamo localizzata proprio lì, alla giunzione neuromuscolare, vicino agli AChR. Cosa succedeva se la toglievamo di mezzo proprio nelle cellule muscolari? Abbiamo usato la tecnica CRISPR/Cas9 per creare cellule muscolari “knockout” per CaMK2β (Camk2b-KO). E qui, il colpo di scena: nonostante l’assenza di CaMK2β, quando stimolavamo le cellule con Agrina, la fosforilazione di MuSK (sia tirosina che S751) e quella del recettore AChRβ non cambiavano affatto rispetto alle cellule normali! Com’era possibile? Abbiamo notato che le cellule KO compensavano aumentando l’espressione di altre varianti di CaMK2 (probabilmente α e/o δ, che avevamo visto essere attive anche *in vitro*). Tuttavia, un effetto c’era: le cellule KO mostravano una ridotta capacità di formare cluster di AChR in risposta all’Agrina. Quindi, CaMK2β sembrava importante per l’aggregazione dei recettori, ma non indispensabile per la fosforilazione di MuSK nelle cellule muscolari, forse grazie alla compensazione da parte delle sue “sorelle”.

Il Test Definitivo: I Modelli Murini

Le cellule in coltura sono utili, ma la vera prova del nove è l’*in vivo*, nell’organismo complesso. Ci siamo chiesti: questa interazione (o la sua mancanza) ha conseguenze in un topo intero? Abbiamo esaminato due modelli murini.

• Il modello di Distrofia Miotonica di Tipo 1 (DM1): Questi topi (Mbnl1^ΔE3/ΔE3) hanno un difetto nello splicing che porta, tra le altre cose, a una riduzione della variante muscolare specifica di CaMK2β (CaMK2βM) e a GNM frammentate. Ci siamo chiesti: la frammentazione è dovuta a una cattiva attivazione di MuSK causata dalla mancanza di CaMK2βM? Abbiamo analizzato i muscoli di questi topi. Sorprendentemente, abbiamo trovato che la quantità totale di proteina MuSK era aumentata (circa 5 volte!), ma la sua fosforilazione (il suo stato di attivazione) a livello della GNM era normale. Anche i livelli totali di altre CaMK2 sembravano leggermente aumentati, suggerendo ancora una compensazione. Conclusione: la mancanza di CaMK2βM in questo modello non causa problemi nell’attivazione di MuSK alla GNM e non è quindi la causa diretta della frammentazione sinaptica.
• Il modello Knockout Globale per CaMK2β: Questi topi (Camk2b^-/- o Camk2b^ΔE2/ΔE2) mancano completamente di CaMK2β in tutto il corpo. Soffrono di problemi di coordinazione motoria (atassia) e ritardo nella crescita. Abbiamo esaminato le loro GNM. Ancora una volta, la fosforilazione di MuSK, sia a livello biochimico nell’intero muscolo sia specificamente alla GNM, era del tutto normale. Analizzando la morfologia delle GNM, abbiamo visto che erano intatte, senza segni di frammentazione. Interessante notare che, mentre i livelli totali di altre CaMK2 nel muscolo non cambiavano (indicando compensazione), la quantità di CaMK2 presente specificamente alla GNM era ridotta, ma non assente. Questo conferma che altre isoforme (probabilmente δ) possono raggiungere la GNM e svolgere le funzioni essenziali, compensando l’assenza di β.

Cosa Abbiamo Imparato (e Cosa Resta da Capire)

Quindi, tiriamo le somme. Abbiamo identificato CaMK2β (e le sue sorelle α e δ) come chinasi capaci di fosforilare MuSK sulla serina S751, un evento che *in vitro* e in cellule eterologhe sembra potenziare l’attivazione di MuSK. Tuttavia, quando abbiamo tolto CaMK2β dalle cellule muscolari o da topi interi, la fosforilazione di MuSK è rimasta magicamente intatta, probabilmente grazie alla compensazione da parte delle altre isoforme di CaMK2. Questo ci dice che, sebbene l’interazione CaMK2β-MuSK sia biochimicamente possibile, non è indispensabile per l’attivazione di MuSK *in vivo* alla giunzione neuromuscolare. La natura ha evidentemente previsto dei meccanismi di backup per una funzione così cruciale!

Questo non significa che CaMK2β sia inutile alla GNM. La ridotta aggregazione degli AChR nelle cellule KO e i problemi nei topi DM1 (che vengono parzialmente risolti ridando CaMK2β) suggeriscono che CaMK2β svolga altri ruoli importanti, forse nel riciclo dei recettori o nella stabilità strutturale della sinapsi, attraverso meccanismi che però sembrano indipendenti dalla fosforilazione di MuSK.

Inoltre, l’analisi dei topi knockout globali ha rivelato un altro aspetto interessante: questi animali mostrano alterazioni nel tipo e nella dimensione delle fibre muscolari. In particolare, nel muscolo soleo (un muscolo prevalentemente lento), c’è uno spostamento verso fibre più veloci (da tipo I a tipo IIX) e una generale riduzione del diametro delle fibre (atrofia) in diversi tipi di muscolo. Questo indica che CaMK2β gioca un ruolo anche nella determinazione del tipo di fibra muscolare e nel mantenimento della loro dimensione, probabilmente influenzando l’espressione genica nel nucleo muscolare.

Insomma, abbiamo risolto un pezzo del puzzle, escludendo un legame funzionale indispensabile tra CaMK2β e l’attivazione di MuSK *in vivo*, ma abbiamo aperto nuove porte su altri ruoli affascinanti di CaMK2β nel muscolo e alla GNM. La ricerca continua!

Fonte: Springer