mTOR: Il Regista Nascosto del Ferro nei Nostri Muscoli e la Chiave della Ferritinofagia

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di qualcosa di affascinante che succede dentro i nostri muscoli, qualcosa che li mantiene sani e forti, o che, se va storto, può contribuire a creare problemi. Parliamo di ferro e di un protagonista molecolare chiamato mTOR.

Forse sapete già che il ferro è essenziale per il nostro corpo, trasporta l’ossigeno, aiuta a produrre energia… insomma, è vitale. Circa il 10-15% del ferro totale del nostro corpo si trova proprio nei muscoli scheletrici, distribuito in varie “ferroproteine” come la mioglobina (che dà quel bel colore rosso alla carne e aiuta a immagazzinare ossigeno) e in enzimi cruciali, specialmente per i nostri mitocondri, le centrali energetiche delle cellule. Il ferro è anche un componente chiave dei cosiddetti cluster ferro-zolfo (ISC), fondamentali per un sacco di reazioni biochimiche.

Ma come spesso accade in biologia, il troppo stroppia. Sia la carenza che l’eccesso di ferro possono danneggiare i muscoli. Troppo ferro può causare stress ossidativo, problemi ai mitocondri, insulino-resistenza e persino deperimento muscolare. Lo si vede in condizioni come l’invecchiamento, l’immobilizzazione prolungata, e in modelli animali di malattie come la SLA o la Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD). D’altro canto, anche la carenza di ferro compromette la salute muscolare in diverse malattie croniche.

Quindi, come fa il nostro corpo a mantenere questo delicato equilibrio? Esistono meccanismi sofisticati che regolano l’assorbimento (tramite il recettore della transferrina, TFR1), l’immagazzinamento (nella proteina ferritina, FTL e FTH) e l’esportazione del ferro (tramite la ferroportina, FPN). Questa regolazione avviene sia a livello di “trascrizione” (quanti geni vengono “letti” per produrre le proteine) sia a livello “post-trascrizionale” (cosa succede alle molecole di RNA messaggero o alle proteine stesse dopo essere state prodotte).

I Grandi Regolatori del Ferro

A livello trascrizionale, i principali registi sono fattori come NRF2 (NFE2L2) e i fattori inducibili dall’ipossia (HIF1α/HIF2α). NRF2 spinge la produzione di ferritina e ferroportina, mentre HIF1α aumenta TFR1 e HIF2α regola DMT1 (un altro trasportatore di metalli) e FPN.

A livello post-trascrizionale, entrano in gioco le proteine regolatrici del ferro (IRP1 e IRP2). Quando c’è poco ferro, le IRP si legano a specifiche sequenze sull’RNA messaggero (chiamate IRE) bloccando la produzione di ferritina e ferroportina (che immagazzinano ed esportano ferro) e stabilizzando l’RNA di TFR1 (che importa ferro). Quando invece il ferro abbonda, IRP1 si trasforma in un enzima (aconitasi citosolica) e IRP2 viene degradata grazie a un’altra proteina, FBXL5.

Infine, c’è un processo chiamato ferritinofagia: una forma di “pulizia cellulare” selettiva (autofagia) che si attiva quando serve ferro. Una proteina chiamata NCOA4 agisce come un “netturbino” che porta la ferritina (piena di ferro) agli autofagosomi, dove viene smantellata per liberare il ferro. Curiosamente, HIF2α promuove questo processo stimolando la produzione di NCOA4, e anche NRF2 ha un ruolo nel coordinare sia la sintesi che il riciclo della ferritina.

E mTOR Cosa C’entra?

Qui arriva il bello. Ricerche precedenti su linee cellulari avevano già suggerito che mTOR, un sensore chiave dello stato nutrizionale ed energetico della cellula, fosse coinvolto nella regolazione del ferro. Ad esempio, inibire mTORC1 (uno dei due complessi formati da mTOR) riduce TFR1, causando inizialmente carenza di ferro, che poi attiva le IRP, le quali bloccano la sintesi di FPN, portando infine ad un accumulo di ferro *dentro* la cellula. Anche mTORC2 sembra avere un ruolo epigenetico. Inoltre, mTORC1 potrebbe favorire la formazione dei cluster ferro-zolfo (ISC) e interagire con NRF2 e HIF.

Tuttavia, studi su topi con mTOR eliminato specificamente nel cuore non avevano mostrato alterazioni evidenti nel bilancio del ferro. Servivano quindi più ricerche, specialmente nel muscolo scheletrico.

Noi avevamo già visto che eliminare mTOR specificamente nel muscolo scheletrico di topo (topi mTORmKO) causa una miopatia progressiva, con fibre muscolari più piccole, debolezza e morte prematura. I muscoli lenti-ossidativi (come il soleo) sono i più colpiti, con problemi ai mitocondri e degenerazione marcata. I muscoli veloci-glicolitici mostrano più accumulo di glicogeno e lievi segni distrofici. Inoltre, questi muscoli mostrano un’induzione cronica dell’autofagia, ma con un “flusso” autofagico che diminuisce con l’età.

Il Paradosso del Ferro nei Topi mTORmKO

Nel nostro studio recente, abbiamo voluto indagare proprio l’impatto della mancanza di mTOR sull’omeostasi del ferro nel muscolo di topo e capire se questo contribuisse alla miopatia. Abbiamo usato topi mTORmKO su un background genetico C57BL/6J puro, che mostrano una progressione della malattia leggermente più lenta rispetto ai nostri studi precedenti.

Abbiamo misurato il contenuto di ferro nel muscolo soleo (ricco di fibre lente) e plantare (PLA, ricco di fibre veloci) a 7 e 25 settimane di età. Sorprendentemente, nei topi giovani (7 settimane), il soleo dei mTORmKO aveva *meno* ferro (-22-28%) rispetto ai controlli, in parallelo a una riduzione della mioglobina. Nel plantare, invece, non c’erano differenze significative.

Ma con il progredire della miopatia (a 25 settimane), i livelli di ferro nel soleo dei mTORmKO maschi tornavano a livelli simili ai controlli, nonostante la mioglobina restasse bassa. Anche nel plantare i livelli rimanevano normali. Risultati simili li abbiamo visti nelle femmine di 25 settimane. Quindi, la mancanza di mTOR scombussola l’omeostasi del ferro soprattutto nel soleo, con una carenza iniziale seguita da una normalizzazione apparente con l’avanzare della malattia.

Analizzando altri metalli, abbiamo visto un aumento dello zinco (tipico dell’atrofia muscolare) e una riduzione di rame e manganese in entrambi i tipi di muscolo e a entrambe le età.

Un Equilibrio Apparente che Nasconde Problemi

Anche se a 25 settimane il livello totale di ferro nel soleo sembrava normale, abbiamo visto un aumento del ferro ferrico (FeIII) e una diminuzione del ferro ferroso (FeII, quello metabolicamente più attivo). Tuttavia, non abbiamo trovato accumuli localizzati di ferro ferrico (visibili con la colorazione di Perls), a differenza della milza usata come controllo positivo. Coerentemente con la riduzione del FeII (che può promuovere stress ossidativo), non abbiamo trovato segni di danno ossidativo (perossidazione lipidica o ossidazione delle proteine) nei muscoli mTORmKO. Anzi, nel soleo erano addirittura inferiori ai controlli.

Quindi, la perdita di mTOR è essenziale per l’equilibrio del ferro nei muscoli lenti, ma non sembra causare direttamente danno ossidativo. La riduzione di FeII, però, potrebbe limitare la disponibilità di ferro per la sintesi dei cluster ferro-zolfo (ISC), cruciali per la respirazione mitocondriale. Abbiamo anche visto una riduzione delle proteine coinvolte nell’assemblaggio degli ISC (ISCU e Fratassina, FXN) nel soleo dei topi più vecchi, ma non in quelli giovani. Tuttavia, anche l’espressione dei geni (mRNA) per queste proteine e per altre proteine mitocondriali contenenti ISC era ridotta. Analizzando un processo sensibile ai difetti degli ISC (la lipoilazione della proteina PDH), non abbiamo trovato prove definitive di un problema intrinseco nella formazione degli ISC dovuto alla mancanza di mTOR. Sembra più probabile che i cambiamenti mitocondriali osservati siano una conseguenza del rimodellamento del muscolo durante la progressione della miopatia, legata a difetti nel regolatore PGC-1α che avevamo già identificato.

Il Vero Inganno: Espressione Genica Scombussolata

Per capire meglio cosa stesse succedendo, abbiamo guardato l’espressione delle proteine chiave del metabolismo del ferro nei muscoli (soleo e tibiale anteriore, TA, un muscolo misto) di topi di 20-23 settimane. Qui è emerso il vero paradosso:

• TFR1 (recettore per l’assorbimento): Proteina e mRNA drasticamente ridotti nel soleo mTORmKO.
• Ferritina (FTL e FTH, per l’immagazzinamento): Proteine aumentate di 4-5 volte!
• Ferroportina (FPN, per l’esportazione): Proteina aumentata circa 3 volte.

La cosa stranissima è che, mentre le proteine di ferritina e ferroportina aumentavano (un segnale tipico di *eccesso* di ferro), i loro mRNA erano invece *ridotti*! Questo indica chiaramente una regolazione che avviene *dopo* la trascrizione del gene. Questi cambiamenti erano già presenti nei topi giovani (7 settimane) e anche nel muscolo TA, meno colpito dalla distrofia.

Questo ci dice che la mancanza di mTOR scombussola il profilo di espressione dei geni legati al ferro, indipendentemente dal contenuto totale di ferro o dalla gravità della patologia muscolare. Sembra proprio che mTOR abbia un ruolo diretto nel mantenere la corretta espressione di questi geni nel muscolo.

I Colpevoli: NRF2 e HIF Vanno in Tilt

Come spiegare questa discordanza tra mRNA e proteine? Sappiamo che mTOR può potenziare l’attività di NRF2 e HIF, i fattori trascrizionali che controllano molti geni del ferro. Siamo andati a vedere cosa succedeva a queste vie nei muscoli mTORmKO.
Nel soleo dei topi di 20-23 settimane:

• HIF2α: Drasticamente ridotto sia come proteina che come mRNA. Anche l’mRNA di HIF1α era ridotto. Coerentemente, molti geni bersaglio degli HIF (oltre a TFR1, anche NCOA4, DMT1, geni per l’angiogenesi come VEGF, e SOD2) erano giù. Risultati simili nel TA.
• NRF2: Proteina fortemente ridotta (5 volte!) e mRNA leggermente ridotto. Anche l’attività di NRF2, misurata tramite un suo bersaglio (NQO1), era molto bassa. Molti altri geni bersaglio di NRF2 coinvolti nella risposta allo stress ossidativo (SOD1, GPX4, Catalasi) e nel metabolismo del ferro (HERC2, FECH, FXN) erano ridotti. Risultati simili, ma meno marcati, nel TA. È importante notare che NRF2 era già basso nei topi giovani (7 settimane), suggerendo un legame diretto tra mTOR e NRF2 nel muscolo.

Quindi, la perdita di mTOR smorza l’attività sia di HIF che di NRF2, e questo probabilmente contribuisce alla riduzione degli mRNA dei geni chiave del ferro (Tfr1, Ftl, Fth, Fpn).

Ferritina: Più Sintesi e Meno Smaltimento?

Ma come si spiega l’aumento della *proteina* ferritina se NRF2 (che ne promuove la trascrizione) è basso e l’mRNA di Ftl è ridotto? Qui entra in gioco un meccanismo più complesso legato proprio a NRF2. NRF2 controlla anche un gene chiamato HERC2, che a sua volta regola due processi:

1. Degrada FBXL5, la proteina che fa degradare le IRP (le proteine che bloccano la traduzione dell’mRNA della ferritina).
2. Promuove la degradazione di NCOA4, il “netturbino” della ferritinofagia.

Nei muscoli mTORmKO, con NRF2 basso, anche HERC2 è basso. Cosa succede a valle?

• FBXL5: La sua proteina aumenta (nonostante l’mRNA sia basso). Questo porta a una riduzione delle proteine IRP1 e IRP2.
• Attività IRP: Abbiamo verificato con un test (REMSA) che l’attività delle IRP di legarsi all’mRNA della ferritina (e quindi di bloccarne la traduzione) era effettivamente ridotta nei muscoli mTORmKO. Questo significa che, anche se c’è meno mRNA di ferritina, quel poco che c’è viene tradotto in proteina molto più efficientemente! Ecco spiegato l’aumento della proteina ferritina.
• NCOA4: La sua proteina aumenta (nonostante l’mRNA sia basso, probabilmente per via della ridotta degradazione mediata da HERC2). Questo dovrebbe *promuovere* la ferritinofagia.

Questi cambiamenti (aumento di FBXL5, riduzione di IRP2, aumento di NCOA4) erano già visibili nei topi giovani (7 settimane), in parallelo alla riduzione di NRF2.

Quindi, la mancanza di mTOR, tramite la riduzione di NRF2, sembra fare due cose apparentemente opposte riguardo alla ferritina: ne aumenta la sintesi (togliendo il freno delle IRP) e contemporaneamente ne stimola il reclutamento per la degradazione (aumentando NCOA4).

L’Autofagia Bloccata Intrappola la Ferritina

Ma c’è un altro pezzo del puzzle. Avevamo visto che nei topi mTORmKO più vecchi, l’autofagia, pur essendo indotta, ha un “flusso” ridotto, cioè la degradazione finale è bloccata. Questo blocco è legato all’attivazione cronica di un’altra via di segnalazione, quella di AKT/PKB (che normalmente è inibita da mTORC1, ma quando manca mTOR, si scatena un feedback che la iperattiva). Se l’autofagia è bloccata, anche la ferritinofagia mediata da NCOA4 non può funzionare bene!

Abbiamo verificato questa ipotesi nelle femmine mTORmKO di 25 settimane. Effettivamente, mostravano segni di blocco autofagico (accumulo di LC3B-II e p62, una proteina che marca il materiale da degradare). E, cosa cruciale, abbiamo visto con l’immunofluorescenza che c’erano molti accumuli di ferritina (FTL) che colocalizzavano con p62 all’interno delle fibre muscolari, indicando che la ferritina veniva reclutata negli autofagosomi ma non degradata. Inoltre, c’era poca colocalizzazione tra FTL e LAMP1 (un marcatore dei lisosomi, dove avviene la degradazione finale). Questo non succedeva nei topi giovani (7 settimane), dove l’autofagia era ancora funzionante.

Quindi, nei topi mTORmKO giovani, l’aumento di ferritina è dovuto principalmente all’aumento della sintesi. Nei topi più vecchi, a questo si aggiunge il contributo della ferritinofagia difettosa, che porta ad un ulteriore accumulo.

La Spermidina Può Sbloccare la Situazione?

A questo punto, ci siamo chiesti: se il problema è (anche) l’autofagia bloccata, possiamo fare qualcosa per riattivarla? Abbiamo provato a somministrare spermidina, una molecola naturale nota per indurre l’autofagia, a topi femmina di 22 settimane per 3 settimane. La spermidina aveva già mostrato di poter salvare l’autofagia in un altro modello di distrofia muscolare (topi col6a1-/-).

I risultati sono stati incoraggianti! Nel soleo dei topi mTORmKO trattati con spermidina:

• I livelli di proteina FTL si sono significativamente ridotti (circa dimezzati).
• Questo non era dovuto a cambiamenti nella via NRF2/FBXL5/IRP2/NCOA4 (che rimanevano alterati come nei topi non trattati), ma sembrava proprio legato a un miglioramento dell’autofagia.
• Infatti, i marcatori del flusso autofagico (rapporto LC3B-II/I) tendevano a normalizzarsi.
• Ancora più importante, la colocalizzazione tra FTL e p62 diminuiva, mentre aumentava quella tra FTL e LAMP1 (lisosomi). Questo suggerisce fortemente che la spermidina stava aiutando a processare la ferritina accumulata tramite la via autofagica/lisosomiale.

Come agisce la spermidina? Sappiamo che può modulare la via AKT/PKB-FOXO. FOXO è un fattore trascrizionale che promuove l’autofagia ma viene inibito da AKT/PKB. Nei muscoli mTORmKO, AKT/PKB era iperattivato e FOXO (in particolare FOXO3) era meno localizzato nel nucleo (cioè meno attivo), soprattutto nei topi più vecchi. La spermidina ha normalizzato l’attivazione di AKT/PKB e ha parzialmente ripristinato la localizzazione nucleare di FOXO3. Curiosamente, però, non abbiamo visto un aumento dell’espressione dei geni target di FOXO legati all’autofagia, un risultato simile a quello osservato nello studio sui topi col6a1-/-. Questo suggerisce che la spermidina potrebbe creare un ambiente “permissivo” per l’autofagia normalizzando AKT-FOXO, ma che altri meccanismi (magari legati alla deacetilazione di proteine autofagiche) siano più direttamente coinvolti nella riattivazione del processo in queste condizioni.

Ma Basta a Curare la Miopatia?

Purtroppo, nonostante il successo nel ripristinare la ferritinofagia, il trattamento di 3 settimane con spermidina non è stato sufficiente a migliorare significativamente la miopatia generale nei topi mTORmKO. Il peso corporeo non è migliorato, la percentuale di fibre con nuclei centrali (un segno di rigenerazione/danno) non è diminuita, e l’accumulo di glicogeno nei muscoli veloci non si è ridotto. Anzi, abbiamo notato un aumento della percentuale di fibre muscolari molto piccole, forse perché la spermidina stimola le cellule satellite a formare nuove fibre, ma senza mTOR queste non riescono a crescere adeguatamente per mancanza di sintesi proteica. Inoltre, la carenza di mioglobina nel soleo mTORmKO potrebbe compromettere il riciclo del ferro da parte dei macrofagi, importante per la rigenerazione.

Conclusioni e Prospettive

Questo studio ci svela la complessa danza tra mTOR e il metabolismo del ferro nel muscolo scheletrico. Abbiamo visto che la perdita di mTOR crea un quadro paradossale, alterando le vie di segnalazione NRF2, HIF e AKT/PKB. Questo porta a una regolazione sballata dei geni del ferro, con un accumulo di ferritina dovuto sia a un aumento della sua sintesi (via FBXL5-IRP) sia a un blocco del suo smaltimento (ferritinofagia difettosa per via del blocco autofagico legato ad AKT/PKB).

Abbiamo anche dimostrato che la spermidina può intervenire su questo blocco, normalizzando la segnalazione AKT-FOXO e ripristinando, almeno in parte, il processamento della ferritina. Questo suggerisce che la spermidina potrebbe essere una strategia interessante per affrontare i problemi di gestione del ferro legati a un’autofagia difettosa in contesti di distrofia muscolare.

Tuttavia, il nostro lavoro sottolinea anche che ripristinare un singolo processo alterato potrebbe non bastare a curare una malattia complessa come la miopatia da deficit di mTOR, dove sono compromessi anche altri processi vitali come la sintesi proteica e forse la rigenerazione muscolare stessa. Serviranno studi futuri per capire se un trattamento più precoce e prolungato con spermidina possa avere effetti più benefici sul quadro generale della malattia.

In definitiva, abbiamo aggiunto un tassello importante alla comprensione di come i nostri muscoli gestiscono il ferro e di come un regolatore centrale come mTOR orchestri questo processo, aprendo nuove strade per pensare a future terapie per le malattie muscolari.

Fonte: Springer