DNA Silenzioso e Ripetizioni Ribelli: MSH2 è Davvero il Custode nell’X Fragile e nell’Atassia di Friedreich?

Ciao a tutti, appassionati di scienza e misteri del nostro genoma! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel cuore di alcune malattie genetiche complesse, quelle causate dalle cosiddette “espansioni di ripetizioni”. Immaginate il nostro DNA come un lunghissimo testo, e in alcuni punti ci sono delle sequenze di “parole” (brevi sequenze di DNA) ripetute più e più volte. Normalmente va tutto bene, ma quando queste ripetizioni si espandono oltre una certa soglia, possono causare guai seri, portando a malattie come la Sindrome dell’X Fragile (FXS) o l’Atassia di Friedreich (FRDA).

Una delle conseguenze più intriganti di queste espansioni è che spesso inducono cambiamenti “epigenetici”, cioè modifiche chimiche che non alterano la sequenza del DNA in sé, ma ne influenzano l’attività. La più famosa è la metilazione del DNA: piccoli gruppi chimici (metili) si attaccano al DNA, specialmente in regioni ricche di citosina (C) e guanina (G), spesso funzionando come un interruttore che “spegne” il gene associato.

Nella FXS, l’espansione riguarda una ripetizione CGG nel gene FMR1. Superate le 200 ripetizioni, il promotore del gene (la regione che ne avvia la lettura) e le ripetizioni stesse vengono ipermetilate, silenziando il gene e causando la mancanza di una proteina cruciale, la FMRP. Nell’Atassia di Friedreich, invece, l’espansione è di tipo GAA nel gene FXN, e anche qui si osserva ipermetilazione in alcune zone vicine alle ripetizioni, contribuendo alla riduzione della proteina fratassina.

Il Sospettato Principale: MSH2

Ora, entra in scena il nostro protagonista (o forse antagonista?) di oggi: la proteina MSH2. Questa proteina fa parte del sistema di “riparazione degli appaiamenti errati” (Mismatch Repair – MMR), un meccanismo cellulare fondamentale per correggere errori durante la replicazione del DNA e mantenere stabile il genoma. Sappiamo che MSH2 è coinvolta nell’espansione stessa delle ripetizioni in molte di queste malattie. Recentemente, però, è emerso un ruolo ancora più intrigante: sembra che MSH2 sia necessaria per mantenere la metilazione del DNA (e quindi il silenziamento) vicino alle ripetizioni espanse CTG nella Distrofia Miotonica di tipo 1 (DM1).

Questo ci ha fatto drizzare le antenne: e se MSH2 avesse lo stesso ruolo di “guardiano del silenzio” anche nella FXS e nella FRDA? Mantenere la metilazione significa mantenere il gene spento. Se MSH2 fosse responsabile, eliminarla potrebbe riaccendere il gene? Una prospettiva terapeutica mica da ridere!

L’Indagine: MSH2 Sotto la Lente in FXS e FRDA

Per scoprirlo, ci siamo messi al lavoro con le nostre fidate forbici molecolari, il sistema CRISPR/Cas9. Abbiamo preso cellule staminali embrionali (ESC) derivate da pazienti con FXS (con circa 400 ripetizioni CGG nel gene FMR1) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da pazienti con FRDA (con circa 800 ripetizioni GAA nel gene FXN) e abbiamo “messo fuori gioco” il gene MSH2, creando delle linee cellulari “MSH2 knockout” (KO). Ovviamente, abbiamo creato anche linee di controllo (“MSH2 WT”, wild-type) dove MSH2 era perfettamente funzionante.

Abbiamo seguito queste cellule per mesi, monitorando attentamente tre cose:

1. L’espressione genica: Il gene FMR1 (in FXS) o FXN (in FRDA) si riattivava nelle cellule senza MSH2?
2. La metilazione del DNA: La metilazione vicino alle ripetizioni diminuiva senza MSH2? Abbiamo usato tecniche sia quantitative (qPCR specifica per la metilazione) sia super dettagliate (sequenziamento del bisolfito, che ci permette di vedere lo stato di metilazione di ogni singola C seguita da una G in centinaia di molecole di DNA!).
3. La dimensione delle ripetizioni: MSH2 è nota per favorire l’espansione. La sua assenza avrebbe influenzato la stabilità delle ripetizioni?

Risultati Sorprendenti: MSH2 Assolta (per la Metilazione)!

E qui arriva la sorpresa. Contrariamente a quanto visto nella DM1, nelle nostre cellule FXS e FRDA senza MSH2… la metilazione del DNA non è cambiata affatto! Anche dopo più di 100 giorni, le regioni vicino alle ripetizioni espanse rimanevano belle metilate, e i geni FMR1 e FXN rimanevano sostanzialmente spenti.

Abbiamo pensato: forse dipende dalla densità dei siti CpG (i punti dove avviene la metilazione)? La regione vicino alle ripetizioni CTG nella DM1 ha una certa densità, quella vicino alle CGG in FXS è molto più densa (le stesse ripetizioni CGG contengono CpG!), mentre quella vicino alle GAA in FRDA è meno densa. Ma niente, nemmeno nella regione meno densa della FRDA abbiamo visto una diminuzione della metilazione senza MSH2.

Questo risultato è pazzesco! Suggerisce che i meccanismi che mantengono il silenziamento epigenetico indotto dalle ripetizioni non sono universali. Ciò che vale per la DM1 non vale per FXS e FRDA. Esistono evidentemente altri attori, indipendenti da MSH2, che si assicurano che questi geni rimangano spenti una volta superata la soglia critica di ripetizioni.

Un Colpo di Scena: Le Contrazioni Indotte dalla Trascrizione

Ma le sorprese non erano finite. Volevamo capire se MSH2 fosse coinvolta almeno nell’instaurare de novo la metilazione, magari dopo averla rimossa artificialmente. Abbiamo provato a riattivare il gene FMR1 nelle cellule FXS usando uno strumento molecolare chiamato dCas9-TET1, che può essere guidato specificamente sulle ripetizioni CGG per rimuovere la metilazione. L’idea era: togliamo la metilazione, il gene si riaccende; poi vediamo se, senza MSH2, fa più fatica a rimetilarsi e a spegnersi di nuovo.

Il gene si è effettivamente riattivato, producendo mRNA e anche la proteina FMRP! Ma è successo qualcos’altro di totalmente inaspettato e su larga scala: le lunghe ripetizioni CGG (400) hanno subito massicce contrazioni, accorciandosi notevolmente in gran parte della popolazione cellulare. E la cosa più incredibile è che queste contrazioni avvenivano sia nelle cellule con MSH2 sia in quelle senza MSH2!

Quindi, non solo MSH2 non è necessaria per mantenere la metilazione in FXS, ma non è nemmeno indispensabile per tutte le contrazioni delle ripetizioni che avvengono quando il gene viene forzatamente riattivato. Sembra che la trascrizione stessa attraverso queste sequenze ripetute “difficili” possa innescare meccanismi di riparazione o instabilità che portano a contrazioni, e alcuni di questi meccanismi funzionano benissimo anche senza MSH2. Abbiamo osservato contrazioni MSH2-indipendenti anche nelle cellule FRDA.

Cosa Significa Tutto Questo?

Beh, prima di tutto, ci dice che la biologia delle malattie da espansione di ripetizioni è ancora più complessa e sfaccettata di quanto pensassimo. Non possiamo dare per scontato che un meccanismo identificato in una malattia valga automaticamente per le altre, anche se condividono caratteristiche simili come l’espansione di ripetizioni e il silenziamento epigenetico. MSH2 ha ruoli diversi a seconda del contesto specifico del gene e della sequenza ripetuta.

Secondo, la scoperta delle contrazioni MSH2-indipendenti è intrigante. Potrebbe spiegare in parte il “mosaicismo” della dimensione delle ripetizioni che si osserva spesso nei pazienti, dove cellule diverse nello stesso individuo hanno un numero variabile di ripetizioni. Questa variabilità può influenzare la gravità e la manifestazione della malattia.

Infine, apre scenari potenzialmente rivoluzionari per la terapia. Se capiamo come la trascrizione (o gli strumenti che la inducono, come il nostro dCas9-TET1 mirato) possa causare contrazioni, potremmo un giorno sfruttare questo processo per “ridurre” le ripetizioni espanse sotto la soglia patologica. Certo, la strada è lunga e dobbiamo capire bene i meccanismi (sia quelli dipendenti da MSH2 che quelli indipendenti) per poterli controllare in modo sicuro ed efficace.

Insomma, anche se MSH2 è stata “assolta” dall’accusa di essere il guardiano universale della metilazione in queste malattie, la nostra indagine ha aperto nuove porte sulla comprensione dei meccanismi di instabilità delle ripetizioni e sulle possibili strategie future per combattere queste condizioni devastanti. La ricerca continua, e ogni “fallimento” nel confermare un’ipotesi è in realtà un passo avanti verso una comprensione più profonda!

Fonte: Springer