Alpelisib Sotto Lente: Il Metodo UPLC Rivoluzionario con l’Approccio QbD che Cambia le Regole dell’Analisi

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di qualcosa di veramente affascinante che sta succedendo nel mondo dell’analisi farmaceutica. Immaginate di dover controllare la qualità di un farmaco importantissimo, come l’alpelisib. È un farmaco che sta dando nuove speranze nella lotta contro alcuni tipi di cancro al seno e altre condizioni legate a specifiche mutazioni genetiche. Niente male, vero? Ma per essere sicuri che ogni compressa sia perfetta, serve un metodo di analisi super affidabile, preciso e, perché no, anche veloce ed efficiente.

Cos’è l’Alpelisib e Perché Analizzarlo?

Prima di tuffarci nella tecnica, due parole sull’alpelisib. Questo composto, noto anche con il nome commerciale Piqray, è un inibitore di una proteina chiamata PI3K, in particolare della subunità p110α. Questa proteina, quando mutata (cosa che accade in circa il 30% dei tumori umani!), può spingere le cellule a crescere e proliferare senza controllo. L’alpelisib blocca selettivamente questa versione “iperattiva” della proteina, offrendo un’arma mirata contro il cancro. È stato approvato dalla FDA nel 2019 per il cancro al seno avanzato o metastatico (HR-positivo, HER2-negativo, con mutazione PIK3CA) e più recentemente, nel 2022, anche per trattare la sindrome PROS (PIK3CA-Related Overgrowth Spectrum). Insomma, un farmaco davvero promettente!

Ora, capite bene che quando si ha a che fare con molecole così potenti e specifiche, è fondamentale poterle quantificare con estrema precisione, sia nella materia prima (il “bulk”) sia nel prodotto finito (le compresse). Bisogna essere certi che la quantità di principio attivo sia quella giusta e che non ci siano impurezze o prodotti di degradazione indesiderati.

La Sfida: Metodi Complessi e Costosi

Finora, per analizzare l’alpelisib, si sono usati metodi sofisticati come la LC-MS/MS (Cromatografia Liquida accoppiata alla Spettrometria di Massa tandem) o metodi UPLC per l’analisi nel plasma. Esiste anche un metodo LC-Q-TOF-MS/MS che indica la stabilità. Questi metodi sono potentissimi, certo, ma hanno i loro contro: sono spesso complessi da gestire, richiedono strumentazione molto costosa e personale altamente specializzato. Non proprio l’ideale per controlli di routine su larga scala nell’industria farmaceutica, dove servono soluzioni più snelle e sostenibili. E qui entra in gioco la nostra innovazione!

La Nostra Soluzione: UPLC + QbD = Efficienza Intelligente

Abbiamo pensato: perché non sviluppare un metodo che sfrutti la potenza della UPLC (Ultra-Performance Liquid Chromatography) ma che sia più semplice, veloce ed economico? La UPLC è già un passo avanti rispetto alla HPLC tradizionale: usa colonne con particelle piccolissime (nel nostro caso, 1.7 micron!) che permettono separazioni più rapide e con una risoluzione migliore. Ma non ci siamo fermati qui. Abbiamo deciso di applicare l’approccio QbD, ovvero Quality by Design.

Cosa significa QbD? In parole semplici, è un modo sistematico e scientifico per sviluppare un metodo analitico. Invece di andare per tentativi, si definisce prima l’obiettivo (il profilo analitico desiderato), si identificano i parametri critici che influenzano il risultato (come la composizione della fase mobile, il flusso, la temperatura della colonna) e si studia come questi parametri interagiscono tra loro per trovare le condizioni operative ottimali. È un po’ come progettare una ricetta perfetta studiando scientificamente l’effetto di ogni ingrediente e di ogni passaggio!

Per fare questo, abbiamo usato uno strumento statistico chiamato Box-Behnken design. Abbiamo selezionato tre “ingredienti” chiave del nostro metodo UPLC:

• Il rapporto tra i solventi nella fase mobile (una miscela di soluzione tampone di acido formico allo 0.1% e acetonitrile)
• La velocità con cui la fase mobile scorre nella colonna (il flusso)
• La temperatura della colonna

Abbiamo poi misurato due “risultati” critici (le nostre risposte):

• Il tempo che impiega l’alpelisib a uscire dalla colonna (il tempo di ritenzione)
• La forma del picco cromatografico (il tailing factor, che ci dice se il picco è bello simmetrico o se ha una “coda”)

Facendo girare 17 esperimenti pianificati dal design, abbiamo ottenuto dei modelli matematici che descrivono perfettamente come i nostri “ingredienti” influenzano i “risultati”.

Il Metodo Ottimizzato: Veloce, Preciso e Robusto

Grazie all’approccio QbD, abbiamo trovato le condizioni perfette! Eccole qui:

• Colonna: Waters BEH C18 UPLC (2.1 x 50 mm, 1.7 micron) – una garanzia di efficienza!
• Fase Mobile: Miscela 50:50 (V/V) di tampone acido formico 0.1% (pH 3) e acetonitrile. Una combinazione isocratica (cioè la composizione non cambia durante l’analisi), semplice ed efficace.
• Flusso: 0.25 mL al minuto – un flusso ottimizzato per velocità e separazione.
• Temperatura Colonna: Ambiente – nessuna necessità di controlli complessi della temperatura.
• Volume di Iniezione: Solo 4 µL – si usa pochissimo campione.
• Rivelazione: A 246 nm – la lunghezza d’onda ottimale per vedere l’alpelisib.

E il risultato? Un’analisi completata in soli 4 minuti! L’alpelisib esce dalla colonna a circa 1.49 minuti, con un picco bellissimo e simmetrico (tailing factor di 0.99, vicinissimo al valore ideale di 1). Fantastico, no?

Ma Funziona Davvero? La Prova della Validazione ICH

Sviluppare un metodo è una cosa, ma essere sicuri che sia affidabile in ogni condizione è un’altra. Per questo, abbiamo sottoposto il nostro metodo UPLC a una rigorosa validazione seguendo le linee guida internazionali ICH (International Conference on Harmonisation), che sono lo standard d’oro nel settore farmaceutico. Abbiamo verificato:

• Specificità: Il metodo riesce a misurare l’alpelisib senza essere ingannato da altre sostanze presenti nel campione (come gli eccipienti delle compresse o eventuali prodotti di degradazione)? Assolutamente sì! I cromatogrammi del bianco, dello standard e del campione mostrano chiaramente che non ci sono interferenze.
• Linearità: La risposta del metodo è proporzionale alla quantità di alpelisib presente? Sì, in un intervallo di concentrazione da 10 a 50 µg/mL, abbiamo ottenuto una linearità eccellente (R² = 0.9955).
• Precisione: Il metodo dà risultati consistenti se ripetuto più volte nello stesso giorno (intra-day) o in giorni diversi (inter-day)? Certamente! L’RSD (deviazione standard relativa percentuale), che misura la variabilità, era bassissimo (0.3% intra-day e 0.1% inter-day), ben al di sotto del limite accettabile del 2%.
• Accuratezza: Il metodo misura la quantità giusta di farmaco? Abbiamo fatto delle prove aggiungendo quantità note di alpelisib a campioni (spiking) a diversi livelli (50%, 100%, 150%). Il recupero medio è stato del 99.25%, praticamente perfetto e ben dentro i limiti richiesti (98-102%).
• LOD e LOQ: Qual è la quantità minima di alpelisib che il metodo riesce a rilevare (LOD – Limite di Rilevabilità) e a quantificare con precisione (LOQ – Limite di Quantificazione)? I valori calcolati sono ottimi e rientrano nei limiti accettati.

Inoltre, l’approccio QbD ci ha permesso di definire il cosiddetto MODR (Method Operable Design Region), una “zona sicura” all’interno della quale possiamo variare leggermente i parametri critici (flusso, rapporto fase mobile) senza compromettere la qualità del risultato. Questo dimostra che il metodo non è solo preciso, ma anche robusto!

Stabilità Sotto Stress: Il Metodo Supera la Prova del Fuoco

Un aspetto cruciale per un metodo analitico farmaceutico è la sua capacità di essere “stability-indicating“, cioè di separare il principio attivo dai suoi potenziali prodotti di degradazione. Se il farmaco si degrada (per esposizione all’acido, alla base, all’ossidazione, al calore o alla luce), il metodo deve essere in grado di “vedere” questi prodotti di degradazione separatamente dal farmaco intatto.

Abbiamo quindi sottoposto l’alpelisib a condizioni di stress forzato, come richiesto dalle linee guida ICH:

• Trattamento con acido cloridrico (0.1N HCl a 60°C)
• Trattamento con idrossido di sodio (0.1N NaOH a 60°C)
• Trattamento con perossido di idrogeno (30% H₂O₂)
• Esposizione a calore secco (110°C)
• Esposizione alla luce solare

Il nostro metodo UPLC è stato bravissimo! In tutte queste condizioni, è riuscito a separare perfettamente il picco dell’alpelisib da eventuali picchi minori dovuti alla degradazione, confermando la sua specificità e la sua capacità di indicare la stabilità del farmaco. Abbiamo anche verificato la purezza del picco dell’alpelisib in ogni condizione di stress, confermando che sotto il picco principale c’era solo alpelisib.

Perché Questo Metodo è Importante?

Allora, cosa abbiamo ottenuto alla fine di tutto questo lavoro? Abbiamo sviluppato e validato un metodo UPLC per quantificare l’alpelisib che è:

• Rapido: Solo 4 minuti per analisi!
• Sensibile e Preciso: Risultati affidabili e riproducibili.
• Accurato: Misura la quantità corretta di farmaco.
• Specifico e Stability-Indicating: Distingue l’alpelisib dalle impurezze e dai prodotti di degradazione.
• Robusto: Grazie all’approccio QbD, sappiamo che funziona bene anche con piccole variazioni operative.
• Semplice ed Economico: Utilizza una tecnica UPLC isocratica, più accessibile e meno costosa della LC-MS/MS, e riduce il consumo di solventi e tempo.

Questo metodo rappresenta un notevole passo avanti rispetto ai metodi esistenti. L’uso dell’approccio QbD non solo ha garantito la robustezza fin dalla progettazione, ma ha anche reso lo sviluppo più razionale ed efficiente. È la prima volta che viene riportato un metodo UPLC per studi di degradazione forzata sull’alpelisib, aggiungendo un ulteriore elemento di novità.

Insomma, abbiamo tra le mani uno strumento potente e pratico che può essere facilmente implementato nei laboratori di controllo qualità dell’industria farmaceutica per garantire che ogni paziente riceva compresse di alpelisib sicure ed efficaci. È la scienza applicata che fa davvero la differenza!

Fonte: Springer