MARCH8: Il Guardiano Cellulare che Disarma il Virus dell’Afta Epizootica

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di una scoperta davvero intrigante che getta nuova luce sulla battaglia silenziosa che avviene costantemente all’interno delle cellule dei nostri amici animali (e potenzialmente anche nelle nostre, anche se questo studio si concentra sugli animali da allevamento). Parliamo del virus dell’afta epizootica (FMDV), un vero flagello per bovini, suini, ovini e caprini, capace di causare danni economici enormi. Ma, come in ogni buona storia, c’è un eroe, o almeno un potenziale difensore: una proteina chiamata MARCH8.

Una Scoperta Sorprendente: MARCH8 Mette i Bastoni tra le Ruote al Virus

Finora sapevamo che MARCH8, una proteina associata alla membrana cellulare, agisce come un fattore antivirale prendendo di mira le glicoproteine dell’involucro di alcuni virus. Ma l’FMDV è un virus un po’ diverso: è un virus a RNA a singolo filamento positivo e, soprattutto, non ha un involucro! Quindi, la domanda sorgeva spontanea: MARCH8 può fare qualcosa contro un nemico del genere?

Beh, sembra proprio di sì! Nel nostro studio, abbiamo osservato qualcosa di affascinante: quando aumentavamo artificialmente la quantità di MARCH8 nelle cellule (in gergo tecnico, “sovraesprimevamo”), la replicazione dell’FMDV veniva significativamente inibita. E non poco: l’effetto era dose-dipendente, cioè più MARCH8 c’era, meno il virus riusciva a moltiplicarsi. Immaginate MARCH8 come un buttafuori che diventa sempre più severo all’aumentare del suo numero!

Per essere sicuri, abbiamo fatto anche l’esperimento opposto: abbiamo ridotto la quantità di MARCH8 presente naturalmente nelle cellule (usando una tecnica chiamata “knockdown” con shRNA). E cosa è successo? Esatto, l’FMDV ha avuto vita più facile e la sua replicazione è aumentata. Questi risultati, messi insieme, ci dicono chiaramente che MARCH8 gioca un ruolo negativo nella replicazione di questo virus. È un fattore antivirale intrinseco della cellula ospite.

Ma Come Fa? Il Meccanismo d’Azione di MARCH8

Ok, MARCH8 ostacola il virus, ma come fa esattamente, visto che l’FMDV non ha quell’involucro su cui MARCH8 di solito agisce? Qui le cose si fanno ancora più interessanti. Abbiamo indagato sulle possibili interazioni tra MARCH8 e le varie proteine prodotte dal virus FMDV una volta che infetta la cellula. L’FMDV produce una lunga poliproteina che poi viene tagliata in diverse proteine funzionali, sia strutturali (che formano il “guscio” del virus, chiamato capside) sia non strutturali (che aiutano nella replicazione e in altre funzioni).

Utilizzando tecniche come la co-immunoprecipitazione (co-IP), che ci permette di vedere se due proteine si “agganciano” l’una all’altra all’interno della cellula, abbiamo scoperto che MARCH8 interagisce specificamente con tre delle proteine strutturali principali dell’FMDV: VP1, VP2 e VP3. Queste sono proprio le proteine che formano la superficie esterna del capside virale! Abbiamo confermato questa interazione anche visualmente, usando la microscopia confocale, che ci ha mostrato MARCH8 e queste proteine virali localizzate insieme nel citoplasma della cellula infetta.

L’Arma Segreta: Ubiquitinazione e Degradazione Proteasomica

Avere un’interazione è un conto, ma come porta all’inibizione virale? MARCH8 è conosciuta per essere una “E3 ubiquitina ligasi”. Cosa significa? Immaginate l’ubiquitina come una piccola etichetta molecolare che può essere attaccata ad altre proteine. Le E3 ligasi sono gli enzimi che scelgono quali proteine etichettare. Spesso, questa etichettatura (specialmente quando vengono attaccate catene di ubiquitina, o “poliubiquitinazione”) serve come segnale per la cellula che dice: “Questa proteina è da buttare!”. La proteina etichettata viene quindi inviata al “tritarifiuti” cellulare, il proteasoma, e viene degradata.

Abbiamo quindi verificato se MARCH8 stesse facendo proprio questo alle proteine VP1, VP2 e VP3. Ed ecco la conferma: quando MARCH8 era presente, i livelli di queste proteine virali diminuivano drasticamente. Per capire se fosse coinvolto il proteasoma, abbiamo usato un inibitore specifico (MG132). Trattando le cellule con MG132, la degradazione di VP1, VP2 e VP3 mediata da MARCH8 veniva bloccata, e i livelli delle proteine virali venivano ripristinati. Altri inibitori (per i lisosomi o le caspasi, altri sistemi di degradazione cellulare) non avevano questo effetto. Quindi, era chiaro: MARCH8 stava etichettando VP1, VP2 e VP3 per la distruzione tramite il proteasoma.

Non solo, siamo andati ancora più a fondo! Abbiamo scoperto che tipo specifico di catena di poliubiquitina MARCH8 attaccava a queste proteine virali. Esistono diversi modi in cui le molecole di ubiquitina possono legarsi tra loro, formando catene diverse che danno segnali diversi. Nel nostro caso, MARCH8 catalizzava specificamente la formazione di catene legate tramite la lisina in posizione 33 dell’ubiquitina (poliubiquitinazione K33-linked). Una scoperta molto specifica!

Bersaglio Acquisito: I Punti Deboli delle Proteine Virali

Ma dove attacca esattamente MARCH8 queste etichette di ubiquitina sulle proteine VP1, VP2 e VP3? Le proteine sono catene di amminoacidi, e l’ubiquitina di solito si lega a un amminoacido specifico chiamato lisina (Lys, o K). Abbiamo analizzato le sequenze di VP1, VP2 e VP3, identificato i residui di lisina conservati tra diversi ceppi di FMDV e poi creato delle versioni mutate di queste proteine in cui specifiche lisine venivano sostituite con un altro amminoacido (arginina, R), rendendo impossibile l’attacco dell’ubiquitina in quel punto.

Testando queste proteine mutate, abbiamo fatto centro! Abbiamo identificato i siti cruciali:

• Per VP1, la lisina chiave è la numero 210 (K210). La proteina VP1 con la mutazione K210R era resistente alla degradazione da parte di MARCH8.
• Per VP2, la lisina chiave è la numero 63 (K63). La mutante VP2 K63R non veniva degradata.
• Per VP3, la lisina chiave è la numero 118 (K118). Anche la VP3 K118R sfuggiva alla degradazione.

È importante notare che queste mutazioni non impedivano a MARCH8 di legarsi alle proteine virali, ma bloccavano specificamente l’attacco dell’ubiquitina e la successiva degradazione. Quindi, K210 di VP1, K63 di VP2 e K118 di VP3 sono proprio i punti deboli che MARCH8 sfrutta per disinnescare queste componenti virali.

Curiosamente, quando abbiamo provato a creare virus FMDV ricombinanti con queste mutazioni, siamo riusciti a “salvare” (cioè a produrre virus infettivo) solo quello con la mutazione K210R in VP1. I virus con le mutazioni K63R in VP2 o K118R in VP3 (o tutte e tre insieme) non erano vitali. Questo suggerisce che le lisine K63 di VP2 e K118 di VP3 potrebbero essere essenziali non solo per la degradazione da parte di MARCH8, ma anche per la vita stessa del virus, forse per la stabilità del capside o per l’assemblaggio. Il virus mutante K210R, invece, si replicava normalmente ma era ancora sensibile all’inibizione da parte di MARCH8, indicando che forse MARCH8 può agire anche in altri modi o che la degradazione delle altre due proteine (VP2 e VP3) è sufficiente a frenare il virus.

Gli Strumenti del Mestiere: I Domini Essenziali di MARCH8

Infine, ci siamo chiesti quali parti della proteina MARCH8 fossero necessarie per questa sua attività antivirale. MARCH8 ha una struttura particolare, con un dominio chiamato RING-CH (o ZF) che contiene il sito attivo per la sua funzione di E3 ligasi, e due domini transmembrana (TM) che la ancorano alle membrane cellulari.

Abbiamo creato una versione mutata di MARCH8 (MARCH8W112A) incapace di svolgere la sua funzione di E3 ligasi. Come previsto, questa versione mutante non riusciva più a degradare VP1, VP2 e VP3 e, cosa interessante, non riusciva nemmeno più a legarsi ad esse! Questo ci dice che l’attività enzimatica è fondamentale anche per l’interazione fisica. Tuttavia, quando abbiamo testato l’effetto di questa MARCH8 mutante sulla replicazione del virus intero, abbiamo visto che un po’ di attività inibitoria rimaneva, anche se molto ridotta rispetto alla MARCH8 normale. Questo suggerisce che, sebbene la degradazione via ubiquitina sia il meccanismo principale, potrebbero esserci altri modi in cui MARCH8 ostacola il virus.

Per chiarire ulteriormente, abbiamo creato un’altra mutante di MARCH8 a cui mancavano sia il dominio ZF (quello dell’attività E3 ligasi) sia i domini TM (quelli di ancoraggio alla membrana). Questa versione “mutilata” di MARCH8 era completamente incapace di inibire la replicazione dell’FMDV. Questo conferma che sia l’attività di E3 ligasi (localizzata nel dominio ZF) sia la sua localizzazione sulle membrane (garantita dai domini TM) sono cruciali per la sua funzione antivirale contro l’FMDV.

Un Quadro Più Ampio e Prospettive Future

Insomma, questa ricerca ci svela un nuovo meccanismo di difesa cellulare contro il virus dell’afta epizootica. MARCH8 emerge come un fattore antivirale intrinseco che bersaglia direttamente le proteine strutturali VP1, VP2 e VP3, marcandole per la distruzione attraverso la via dell’ubiquitina-proteasoma, utilizzando specificamente catene K33-linked e riconoscendo siti precisi su ciascuna proteina virale.

Questa scoperta non solo amplia la nostra conoscenza sullo spettro antivirale di MARCH8 (che sapevamo già agire contro virus come HIV, Ebola, IAV, SARS-CoV-2) ma apre anche nuove prospettive. Comprendere a fondo queste interazioni ospite-patogeno è fondamentale per sviluppare strategie innovative per controllare l’FMD, una malattia così devastante per il settore zootecnico. Chissà, forse in futuro potremmo pensare a modi per potenziare l’azione di MARCH8 come approccio terapeutico o preventivo. La battaglia tra cellule e virus continua, e ogni nuova scoperta ci fornisce armi e conoscenze preziose!

Fonte: Springer