PCR, Virus Impazziti e Intelligenza Artificiale: Possiamo Prevedere i Falsi Negativi?

Amici scienziati e curiosi, parliamoci chiaro: la PCR, o reazione a catena della polimerasi, è stata la nostra migliore amica (e talvolta nemica, quando i risultati non tornavano!) nel mondo della diagnostica molecolare, specialmente per le malattie infettive. Pensate solo al ruolo cruciale che ha avuto durante la pandemia di COVID-19: ci ha permesso di identificare i positivi, guidare le cure e le strategie di controllo. Un vero e proprio faro nella nebbia!

Il problema, però, è che i virus, specialmente quelli a RNA come il SARS-CoV-2, amano cambiare pelle più spesso di un camaleonte. Queste continue mutazioni possono portare a quella che noi tecnici chiamiamo “erosione della firma genetica”. In parole povere? I test, progettati sulla sequenza genetica di una versione precedente del patogeno, potrebbero non riconoscere più le nuove varianti, sfornando dei pericolosissimi falsi negativi. Un bel grattacapo, vero?

La Sfida: Non Tutte le Mutazioni Sono Uguali

Ecco, il punto è proprio questo. Non ogni singola mutazione che spunta nel genoma virale manda all’aria il nostro test PCR. L’impatto di un “mismatch” – cioè una mancata corrispondenza tra la sequenza del virus e quella dei primer e delle sonde del nostro test – dipende da un sacco di fattori: il design specifico del test, le condizioni in cui facciamo girare la reazione, persino la composizione dei reagenti. Immaginate un puzzle: a volte un pezzo leggermente diverso si incastra lo stesso, altre volte blocca tutto.

Durante la pandemia, abbiamo visto come alcune mutazioni del SARS-CoV-2 abbiano effettivamente causato problemi con alcuni test PCR, e lo stesso è successo in passato con l’influenza. Con i progressi nella sorveglianza genomica, oggi siamo in grado di identificare rapidamente nuove varianti e le loro mutazioni. Ma come facciamo a sapere in anticipo se una di queste mutazioni manderà in tilt un test specifico? Fino ad ora, si facevano analisi in silico (cioè al computer, basate su allineamenti di sequenze) o esperimenti diretti, ma spesso questi studi erano limitati o difficili da generalizzare.

La Nostra Idea: Sfruttare il Machine Learning

Ed è qui che entra in gioco la mia passione: e se potessimo usare l’intelligenza artificiale, o meglio, il machine learning, per prevedere l’impatto di queste mutazioni? L’idea era di “allenare” dei modelli matematici a riconoscere i pattern che portano a un calo significativo delle prestazioni di un test PCR. Un po’ come insegnare a un segugio a fiutare solo le tracce “pericolose”.

Cosa abbiamo fatto, in pratica? Abbiamo preso 15 diversi design di saggi molecolari per il SARS-CoV-2, che puntavano a regioni diverse del suo genoma. Poi, basandoci sulle mutazioni realmente osservate durante la pandemia e segnalate nel database GISAID, abbiamo creato ben 228 “template” di PCR mutati. Un bel campionario di tutto ciò che poteva andare storto: sostituzioni singole, delezioni, mutazioni sui primer, sulla sonda, o su entrambi!

Per ognuno di questi 228 template mutati (e per i corrispondenti 15 template “wild type”, cioè senza mutazioni, come controllo), abbiamo eseguito la PCR in triplicato e a quattro diverse concentrazioni. Abbiamo poi confrontato i valori di Ct (Cycle threshold, quel numerino che ci dice quanto virus c’è) dei template mutati con quelli dei controlli. Una differenza significativa (un ΔCt elevato) indicava un problema.

Questo lavoraccio ci ha fornito un’enorme quantità di dati quantitativi, perfetti per addestrare i nostri modelli di machine learning. Abbiamo scelto sette diversi algoritmi e li abbiamo messi alla prova.

I Risultati: Promesse e Limiti dell’IA

Ebbene, i risultati sono stati davvero incoraggianti! Il modello che si è comportato meglio, un cosiddetto “Random Forest classifier”, ha dimostrato una buona capacità predittiva quando validato con una tecnica chiamata “tenfold cross validation”. Parliamo di una sensibilità dell’82% (la capacità di beccare i veri “problematici”) e una specificità dell’87% (la capacità di non dare falsi allarmi) nel predire se un set di mutazioni avrebbe causato un cambiamento significativo nelle prestazioni del test (usando una soglia di ΔCt > 3 o la mancata rilevazione).

Abbiamo anche analizzato quali caratteristiche delle mutazioni fossero più importanti per il modello. E, sorpresa (ma non troppa per chi mastica di PCR), la distanza delle mancate corrispondenze dall’estremità 3′ dei primer e le variazioni stimate della temperatura di annealing (quella a cui primer e sonda si legano al DNA) sono risultate tra le più influenti. Questo è in linea con quello che già sapevamo dalla letteratura scientifica, il che ci ha dato fiducia nel fatto che il modello stesse “ragionando” in modo sensato.

Tuttavia, c’è un “ma”. Quando abbiamo testato la robustezza dei modelli in uno scenario più difficile, usando una validazione chiamata “Leave-One-Assay-Out Cross Validation” (LOAOCV) – che in pratica significa addestrare il modello su 14 saggi e testarlo sul quindicesimo, mai “visto” prima – le prestazioni sono calate. La sensibilità del nostro Random Forest è scesa al 73,3% e la specificità al 72,4%. Questo ci dice una cosa importante: i modelli, così come li abbiamo addestrati e con le caratteristiche che abbiamo usato, faticano un po’ a generalizzare su design di primer e sonde completamente nuovi.

Cosa Significa Tutto Questo?

Significa che l’approccio è promettente, eccome! Siamo riusciti a costruire modelli di machine learning capaci di predire con buona accuratezza l’impatto di mutazioni non ancora viste su design di primer/sonde che, però, erano già inclusi nel training del modello. Questo è già un passo avanti enorme. Immaginate di avere un test PCR molto diffuso: con un sistema del genere, potremmo monitorare le nuove mutazioni emergenti e avere una stima di quali potrebbero iniziare a dare problemi, permettendoci di agire d’anticipo.

La sfida per il futuro? Rendere questi modelli ancora più generalizzabili. Probabilmente dobbiamo includere caratteristiche più sofisticate che descrivano meglio le differenze nucleotidiche specifiche e l’impatto delle condizioni della PCR (come i reagenti o il protocollo di ciclizzazione termica). Infatti, nel nostro studio abbiamo notato delle discrepanze con dati pubblicati su alcune specifiche mutazioni, e ipotizziamo che queste differenze siano dovute proprio ai diversi protocolli e strumenti usati. Un modello addestrato con dati da un protocollo specifico potrebbe non essere perfetto per un altro.

Nonostante queste limitazioni, credo fermamente che il machine learning abbia un potenziale enorme per aiutarci a prevedere l’erosione della firma genetica nei test diagnostici, specialmente per virus ad alto tasso di mutazione come l’influenza o, appunto, il SARS-CoV-2. È uno strumento in più nel nostro arsenale per garantire che la diagnostica molecolare resti affidabile ed efficace, anche di fronte a nemici in continua evoluzione.

La strada è ancora lunga per un modello “universale”, ma ogni passo avanti ci avvicina a una diagnostica più intelligente e predittiva. E questo, per chi come me lavora ogni giorno per migliorare la salute pubblica, è una motivazione fortissima!

Fonte: Springer