Lipopolimeri Ionizzabili Split-Ugi: La Rivoluzione Silenziosa per Consegnare RNA ai Polmoni!

Ragazzi, avete mai pensato a come potremmo “spedire” farmaci super specifici, come l’RNA, direttamente dove servono, tipo nei nostri polmoni? Sembra fantascienza, ma è una delle sfide più calde nella medicina moderna, specialmente dopo il successo strabiliante dei vaccini a mRNA contro il COVID-19, che usavano nanoparticelle lipidiche (LNP). Quel successo ha dato una spinta pazzesca alla ricerca di nuovi sistemi di consegna non virali: vogliamo che siano sicuri, super efficaci, capaci di viaggiare nel corpo e colpire il bersaglio giusto. Raggiungere questi obiettivi aprirebbe le porte a terapie incredibili, come la terapia genica sostitutiva o l’immunoterapia contro il cancro.

La Sfida: Far Arrivare l’RNA a Destinazione (e Farlo Funzionare!)

Il problema è che questi sistemi di consegna devono fare un sacco di cose:

• Proteggere l’mRNA dalla degradazione nel nostro corpo.
• Aiutare la nanoparticella a entrare nelle cellule giuste.
• Permettere all’mRNA di “scappare” da una specie di “prigione” cellulare chiamata endosoma, per poter poi essere tradotto in proteine funzionanti.

E non è finita qui! La dimensione dell’mRNA conta: molecole più grandi sono più fragili e difficili da “impacchettare”, rendendo tutto più complicato e costoso. Finora, le soluzioni trovate erano spesso super specifiche per un’unica applicazione. Quello che servirebbe davvero è un sistema “universale”, capace di gestire mRNA di diverse dimensioni, magari anche miscele, senza dover cambiare tutto ogni volta. Immaginate l’accelerazione che darebbe alla ricerca e allo sviluppo di nuove terapie!

La Nostra Scommessa: Il PEI Modificato con la Reazione Split-Ugi

Da decenni si studia un polimero cationico chiamato Poli(etilenimmina) (PEI) per la consegna genica. È bravo a fare il suo lavoro, ma c’è un compromesso: le versioni più efficaci tendono ad essere tossiche, specialmente per l’uso in vivo. La sua alta densità di carica positiva interagisce troppo forte con le membrane cellulari, causando problemi. Ma ecco l’idea: e se modificassimo chimicamente il PEI? Potremmo ridurne la carica, abbassare la tossicità e magari migliorare pure l’efficacia! Già in passato si è visto che aggiungere gruppi idrofobici (che “non amano” l’acqua) può aiutare molto.

Noi abbiamo pensato di usare una reazione chimica multicomponente molto versatile, ma poco usata per modificare polimeri: la reazione split-Ugi. È una variante della classica reazione di Ugi, perfetta per i gruppi amminici secondari presenti nel PEI lineare che abbiamo scelto come base. Questa reazione ci permette di attaccare al PEI diverse “decorazioni” chimiche: un gruppo amminico terziario (che può diventare carico, cioè ionizzabile) con due “code” derivanti da un’aldeide e un isocianuro, e un gruppo ammidico derivante da un acido carbossilico. In pratica, trasformiamo il PEI in un lipopolimero ionizzabile, che assomiglia un po’ ai lipidi cationici, noti per essere ottimi agenti di trasfezione.

Una “Biblioteca” di 155 Lipopolimeri: Alla Ricerca del Campione

Armati della reazione split-Ugi, abbiamo creato una vera e propria “biblioteca” di 155 lipopolimeri diversi, giocando con:

• Quattro diversi pesi molecolari di PEI lineare (e anche uno a stella).
• Diversi gradi di modificazione (dal 25% al 100%).
• Una piccola libreria di aldeidi, isocianuri e acidi carbossilici per variare le “decorazioni”.

Abbiamo verificato con tecniche come la NMR che le modifiche fossero avvenute (anche se l’incorporazione dell’acido carbossilico era un po’ variabile). Poi abbiamo formulato questi lipopolimeri in “poliplexes” (complessi polimero-mRNA) e li abbiamo testati in vitro su cellule HeLa (per vedere la trasfezione dell’mRNA del gene della luciferasi, Fluc) e su cellule speciali HEK293 Gal9-GFP (per misurare la capacità di fuga dall’endosoma).

I risultati? Sono emerse tendenze interessanti! I polimeri più idrofobici sembravano funzionare meglio. Anche la posizione delle catene idrofobiche contava. Tra gli acidi carbossilici, il più corto (acido acetico) dava i risultati migliori. E, a differenza del PEI “nudo”, qui i polimeri con peso molecolare più basso e con un grado di modificazione più alto erano i più performanti. Sorprendentemente, quasi tutti i polimeri facilitavano bene la fuga dall’endosoma, ma molti meno erano bravi a far esprimere l’mRNA. Tra i migliori candidati in vitro, abbiamo identificato un “campione”: U155. Era stabile, formava particelle di dimensioni adeguate ed era pronto per i test in vivo! U155 è ottenuto modificando un PEI di peso molecolare specifico (P5) con decanale (A5), dodecilisocianuro (B4) e acido acetico (C1), mirando a una modificazione del 100%.

Dalla Provetta al Topo: Nascono le Nanoparticelle Ibride U155@lipids

Abbiamo quindi testato U155 in vivo, iniettando i poliplexes con mRNA Fluc in topi. I risultati sono stati pazzeschi: un segnale bioluminescente fortissimo, soprattutto nei polmoni e nella milza, ben 50 volte superiore a quello ottenuto con un prodotto commerciale standard (in vivo-JetPEI®)! Però, c’era un problema: questi poliplexes U155, essendo molto idrofobici e carichi positivamente, tendevano ad aggregarsi, formando particelle troppo grandi che finivano più nella milza che nei polmoni, probabilmente catturate dalle cellule immunitarie lì presenti.

Come risolvere? Abbiamo pensato a una strategia ibrida: creare nanoparticelle con un cuore di poliplex U155/mRNA e un guscio esterno di lipidi. Questo avrebbe dovuto ridurre la carica superficiale positiva e migliorare la stabilità. Abbiamo usato un approccio a due fasi: prima formiamo il poliplex, poi lo incapsuliamo con una miscela lipidica (contenente DSPG, un lipide anionico che aiuta a dirigere le particelle lontano dal fegato; lecitina di soia; colesterolo per la stabilità; e un lipide PEG per prolungare la circolazione) usando una tecnica chiamata microfluidica. Il risultato? Le nanoparticelle ibride U155@lipids!

Queste nuove particelle erano più piccole (circa 120 nm), meno cariche positivamente (potenziale ζ ridotto) e con un’ottima efficienza di incapsulamento dell’mRNA (>98%). E la cosa migliore? Non solo mantenevano il “tropismo” per i polmoni, ma aumentavano l’espressione dell’mRNA di altre 5 volte rispetto ai poliplexes U155 nudi! Erano ordini di grandezza più potenti di in vivo-JetPEI® e performavano alla pari o meglio di altre LNP avanzate (SORT LNP) mirate ai polmoni. Abbiamo anche notato una risposta alla dose non lineare, un fenomeno già visto per particelle non-epatiche, e che pre-trattare i topi con particelle “vuote” aumentava l’efficacia della dose successiva, suggerendo che si può saturare il meccanismo di eliminazione (probabilmente fagocitosi da parte di macrofagi).

Sicurezza e Cellule Bersaglio: Chi Riceve Davvero l’mRNA?

Fondamentale: queste particelle sono sicure? Abbiamo controllato i polmoni dei topi trattati: nessuna infiammazione acuta significativa, nessun danno tissutale visibile all’istologia (HeE) e nessun aumento di citochine infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNFα) nel sangue. Sembra proprio di sì!

Ma quali cellule nei polmoni ricevono effettivamente l’mRNA consegnato da U155@lipids? Per scoprirlo, abbiamo usato topi speciali (Ai9) che esprimono una proteina fluorescente rossa (tdTomato) solo se ricevono e traducono l’mRNA per l’enzima Cre-ricombinasi. Abbiamo iniettato U155@lipids carichi di mRNA Cre e analizzato le cellule di polmoni, milza e fegato. Come previsto dalla bioluminescenza, i polmoni erano l’organo principale di trasfezione. Analizzando le singole cellule polmonari con citometria a flusso e immunoistochimica (IHC) multipla, abbiamo visto che le cellule più colpite erano le cellule endoteliali (CD45-CD31+, quelle che rivestono i vasi sanguigni) e, sorprendentemente, anche diverse cellule immunitarie (CD45+), inclusi linfociti T (~5%) e linfociti B (~1%)! Riuscire a trasfettare i linfociti T in vivo è un risultato notevole, perché apre scenari pazzeschi per l’immunoterapia. L’IHC ha confermato la trasfezione di cellule endoteliali e immunitarie, mostrando anche che le particelle raggiungono sia i vasi sanguigni che quelli linfatici.

Applicazioni Terapeutiche: Dalla Teoria alla Pratica

Ok, la piattaforma funziona, è sicura e colpisce cellule interessanti. Ma può fare qualcosa di utile? Abbiamo provato due strade:

1. Immunoterapia del Cancro Polmonare: Abbiamo usato un modello murino di cancro ai polmoni (Lewis Lung Carcinoma, LLC-Lum) e trattato i topi con U155@lipids carichi di mRNA per l’interleuchina-12 (IL-12). L’IL-12 è una citochina che stimola il sistema immunitario a combattere i tumori. Risultato: i topi trattati hanno mostrato alti livelli di IL-12 nel sangue, la crescita tumorale è stata significativamente ritardata e la loro sopravvivenza è aumentata rispetto ai controlli (trattati con PBS o con mRNA irrilevante mCherry). Anche dopo dosi multiple, l’efficacia si manteneva.

2. Fibrosi Cistica (Modello): Volevamo vedere se la nostra piattaforma poteva gestire anche mRNA molto grandi e complessi. Abbiamo scelto l’mRNA per la proteina CFTR umana (hCFTR), che è difettosa nella fibrosi cistica ed è una molecola bella grossa (6132 basi!). Abbiamo iniettato U155@lipids con hCFTR mRNA in topi normali e abbiamo confermato la presenza dell’mRNA nei polmoni. Poi, in topi knockout per CFTR (che mimano la malattia), abbiamo visto che l’mRNA veniva tradotto nella proteina hCFTR, che veniva correttamente processata e inserita nella membrana cellulare (analisi Western Blot). Ma la prova del nove era la funzionalità: abbiamo somministrato le particelle per via intranasale (per colpire meglio le cellule epiteliali delle vie aeree) e misurato la differenza di potenziale nasale (NPD), un test che valuta la funzione del canale CFTR. Ebbene, nei topi trattati, la funzione del canale CFTR è stata ripristinata! Questo dimostra che possiamo consegnare mRNA grandi e complessi, mantenendo la loro capacità di produrre proteine funzionanti.

Editing Genetico In Vivo: Il Prossimo Livello

Visto che colpivamo cellule endoteliali e T, abbiamo osato ancora di più: usare U155@lipids per consegnare il sistema CRISPR-Cas9 direttamente nei polmoni per fare editing genetico in vivo.

• Editing nelle cellule polmonari (Ai9): Abbiamo caricato le particelle con mRNA per Cas9 e un RNA guida (sgRNA) per tagliare una sequenza “stop” nel gene tdTomato dei topi Ai9. Risultato: abbiamo ottenuto un editing genetico (misurato come inserzioni/delezioni, indels) del 5.6% nel tessuto polmonare totale (principalmente nelle cellule endoteliali, come visto con IHC). L’efficienza era inferiore a quella della Cre-ricombinasi, ma dimostrava la fattibilità.
• Editing nei linfociti T (PD-1): Abbiamo mirato al gene PD-1 nei linfociti T. PD-1 è un “freno” per l’attività antitumorale dei T. Spegnerlo è una strategia chiave in immunoterapia. Abbiamo pre-attivato i T con una dose di IL-12 mRNA, poi somministrato U155@lipids con Cas9 mRNA e sgRNA anti-PD1. Risultato: abbiamo ottenuto un editing fino allo 0.29% sia nei linfociti T CD4+ che CD8+! È un livello ancora basso, ma è la prova di principio che possiamo modificare geneticamente i T in vivo con questo sistema non virale.

Come Funziona e Cosa Ci Aspetta?

Pensiamo che il tropismo polmonare di U155@lipids sia “passivo”: le particelle, anche se meno cariche delle originali, interagiscono ancora elettrostaticamente con componenti del sangue carichi negativamente, formando forse piccoli aggregati che si “incastrano” nei capillari polmonari, dove il flusso sanguigno è più lento e l’area superficiale enorme. Questo favorisce l’assorbimento da parte delle cellule endoteliali. L’efficacia della via intranasale per la CFTR supporta l’idea che la via di somministrazione influenzi le cellule colpite.

In conclusione, abbiamo messo a punto un metodo efficiente (split-Ugi) per creare una libreria di lipopolimeri ionizzabili derivati dal PEI. Abbiamo identificato un candidato promettente (U155) e sviluppato una formulazione ibrida lipopolimero-lipide (U155@lipids) che mostra un’incredibile efficacia e specificità per la consegna di mRNA ai polmoni dopo somministrazione sistemica (endovena). Questa piattaforma è versatile: gestisce mRNA di diverse dimensioni, permette dosi multiple, è ben tollerata e può essere usata persino per l’editing genetico in vivo nelle cellule polmonari, incluse le difficili da raggiungere cellule T.

Certo, c’è ancora spazio per migliorare, magari usando polimeri biodegradabili o ottimizzando ulteriormente la composizione lipidica. Ma i risultati sono entusiasmanti e aprono prospettive incredibili per nuove terapie geniche mirate ai polmoni, dal cancro alla fibrosi cistica, fino all’immunoterapia avanzata. La strada è aperta!

Fonte: Springer