Barriera Emato-Encefalica Sotto la Lente: Come Ottimizzare l’Isolamento dei Vasi Sanguigni (e Perché la Gerarchia Conta!)

Ciao a tutti, appassionati di scienza e curiosi del corpo umano! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante, quasi da detective, nel labirintico mondo del nostro cervello, o meglio, in quello dei nostri amici murini che tanto ci aiutano nella ricerca. Parleremo di una struttura tanto piccola quanto cruciale: la barriera emato-encefalica (BBB). Immaginatela come un buttafuori super selettivo all’ingresso di un club esclusivissimo (il nostro cervello), che decide chi entra e chi resta fuori. Fondamentale, no?

Il Cuore del Problema: Isolare i Capillari della BBB

La BBB è formata principalmente da una fitta rete di capillari, vasi sanguigni minuscoli con caratteristiche uniche. Sono loro i protagonisti dello scambio selettivo tra sangue e tessuto cerebrale. Studiarli da vicino è essenziale per capire come funziona il cervello in salute e in malattia, e per sviluppare nuove terapie. Ma c’è un “ma”: isolare questi capillari specifici, separandoli da altre cellule cerebrali e, soprattutto, da altri tipi di vasi sanguigni (arterie e vene, che hanno ruoli e strutture diverse), è un po’ come cercare un ago in un pagliaio. Un pagliaio molto, molto complesso.

Nel nostro laboratorio, ci siamo messi all’opera per ottimizzare un protocollo che ci permettesse di arricchire i campioni proprio con questi capillari della BBB, prelevati da cervelli di topo. E, cosa altrettanto importante, abbiamo voluto capire davvero cosa stavamo isolando. Perché, vedete, il sistema vascolare è una gerarchia continua: le arterie portano il sangue, si ramificano in arteriole, poi in capillari (e qui c’è la nostra BBB!), che a loro volta confluiscono in venule e poi in vene. Se il nostro campione “arricchito” contiene troppi “intrusi” (pezzi di arterie o vene), le nostre conclusioni sulla BBB potrebbero essere, diciamo, un po’ fuorvianti.

La Nostra Strategia: Centrifugazione, Filtrazione e Occhi Aperti

Per affrontare questa sfida, abbiamo preso spunto da tecniche esistenti e le abbiamo affinate. Il nostro approccio si basa principalmente su due passaggi chiave dopo aver ottenuto un omogenato di corteccia cerebrale murina:

• Centrifugazione a Gradiente di Densità (DGC): Immaginate di mettere il vostro omogenato in una provetta con una soluzione speciale (Dextran, nel nostro caso) e di farlo girare a velocità folli in una centrifuga. Le diverse componenti si separano in base alla loro densità. Le strutture vascolari, più dense, tendono a depositarsi sul fondo. Questo è il nostro primo “arricchimento”.
• Filtrazione: Dopo la DGC, abbiamo fatto passare la frazione vascolare attraverso un filtro con pori di una certa dimensione (100 µm). L’idea è che i capillari, più piccoli, passino attraverso, mentre i vasi più grandi restino intrappolati.

Abbiamo confrontato tre tipi di campioni: l’omogenato corticale intero (il nostro punto di partenza), i vasi arricchiti solo con DGC, e i vasi arricchiti con DGC e poi filtrati. L’obiettivo era capire quanto materiale non capillare e non vascolare fosse presente in ciascun campione.

Cosa Abbiamo Visto al Microscopio (e Oltre!)

E qui viene il bello! Armati di microscopi confocali e marcatori fluorescenti, abbiamo letteralmente “guardato dentro” i nostri campioni.
Usando topi transgenici che esprimono una proteina fluorescente rossa nelle cellule murali dei vasi (periciti e cellule muscolari lisce, o vSMC) e marcando le cellule endoteliali (il rivestimento interno dei vasi) in blu, abbiamo potuto visualizzare la composizione dei nostri isolati.
Dopo la DGC e la filtrazione, abbiamo notato una notevole riduzione delle cellule non vascolari. Un ottimo risultato! I frammenti di capillari, associati ai periciti, erano ben presenti. Tuttavia, non siamo riusciti a escludere completamente vasi di diametro leggermente maggiore, positivi per l’αSMA (alfa-actina del muscolo liscio), un marcatore tipico delle vSMC presenti in arteriole e venule.

Abbiamo anche confrontato ciò che restava sul filtro da 100 µm e ciò che passava attraverso. Come sospettavamo, sul filtro c’erano vasi più grossi, con molta più αSMA, mentre nel filtrato predominavano i capillari, più piccoli e in gran parte negativi per l’αSMA. Questo ci ha confermato che la filtrazione aiuta a “pulire” il campione, concentrandosi sui microvasi.

Poi siamo passati alle proteine. Con la tecnica del Western Blot, abbiamo misurato i livelli di:

• αSMA: Abbondante nelle arterie/arteriole e vene/venule.
• Claudina-5 (Cldn5): Una proteina delle giunzioni strette tra le cellule endoteliali, cruciale per la funzione di barriera della BBB, ma presente anche in altri vasi cerebrali.
• PECAM-1: Una proteina di adesione quasi onnipresente nelle cellule endoteliali.

I risultati? La DGC aumentava la concentrazione di tutte queste proteine vascolari rispetto all’omogenato di corteccia. La filtrazione, invece, manteneva alti i livelli di Claudina-5 e PECAM-1 (associati alla BBB e agli endoteli in generale) ma riduceva i livelli di αSMA. Questo suggerisce che la filtrazione elimina parte dei vasi più grandi, arricchendo ulteriormente la frazione in capillari della BBB.

E non potevamo tralasciare i geni! Abbiamo analizzato l’espressione di mRNA per vari marcatori. I trascritti di geni associati alle vSMC arteriose (come Acta2 per l’αSMA, Myh11, Cnn1) aumentavano dopo la DGC, ma diminuivano significativamente dopo la filtrazione. Stessa tendenza per marcatori venosi come Ephb4. È interessante notare che un altro marcatore venoso, Nr2f2 (COUP-TFII), diminuiva già con la DGC; questo potrebbe essere dovuto al fatto che è espresso anche in alcuni neuroni, che vengono rimossi efficacemente. Per quanto riguarda i marcatori endoteliali più generali come Cldn5 e Pecam1, i loro trascritti aumentavano con la DGC, ma tendevano a diminuire leggermente con la filtrazione rispetto alla sola DGC. Questa discrepanza tra livelli proteici e di mRNA per Cldn5 e Pecam1 potrebbe riflettere differenze biologiche importanti tra le cellule endoteliali dei capillari e quelle dei vasi più grandi, ma è un aspetto che merita ulteriori indagini.

L’Importanza Critica della Gerarchia Vascolare nell’Analisi

Tutto questo lavoro di caratterizzazione ci porta a un punto fondamentale, che è un po’ il messaggio chiave del nostro studio: quando si studiano i vasi della BBB, è cruciale considerare la gerarchia della rete vascolare. Non basta dire “ho isolato i vasi cerebrali”. Bisogna chiedersi: “Quali vasi ho isolato? Quanti capillari puri della BBB ci sono nel mio campione? E quanti ‘contaminanti’ da arteriole o venule?”.
Questa consapevolezza è essenziale per interpretare correttamente i dati. Se, per esempio, troviamo un cambiamento in un marcatore dopo un certo trattamento, dobbiamo essere sicuri che quel cambiamento stia avvenendo nei capillari della BBB e non, magari, nelle poche arteriole rimaste nel campione.
Il nostro approccio, che combina DGC e filtrazione, seguito da un’attenta analisi visiva, proteica e trascrizionale, ci aiuta a ottenere campioni più rappresentativi dei capillari della BBB e, soprattutto, a capire meglio i limiti del nostro arricchimento.

Sfide, Limitazioni e Prospettive Future

Certo, come in ogni studio scientifico, ci sono delle limitazioni. I vasi isolati sono rimossi dal loro ambiente nativo, e questo potrebbe influenzarli. Inoltre, ci siamo concentrati su un set specifico di marcatori; studi futuri potrebbero ampliarne la gamma, includendo magari più marcatori per distinguere meglio i periciti dalle vSMC o per caratterizzare le cellule non vascolari residue.
Nonostante ciò, crediamo che questo protocollo ottimizzato e, soprattutto, l’approccio critico all’analisi del materiale raccolto, siano un passo avanti importante. Queste metodologie possono essere applicate a una vasta gamma di studi focalizzati sulla BBB: dalla comprensione di malattie neurodegenerative come l’Alzheimer, dove la BBB gioca un ruolo sempre più riconosciuto, allo sviluppo di farmaci che devono attraversare questa barriera per raggiungere il cervello, o ancora allo studio degli effetti di ictus e diabete sulla vascolatura cerebrale.

Tirando le Somme: Un Metodo Affinato per Svelare i Segreti della BBB

In conclusione, la nostra “avventura” ci ha permesso di mettere a punto una strategia più efficace per arricchire i campioni in capillari della BBB da tessuto murino. Ma, ancora più importante, abbiamo sottolineato quanto sia fondamentale analizzare con occhio critico ciò che si ottiene, tenendo sempre presente la complessa gerarchia della rete vascolare cerebrale. Solo così potremo attribuire con maggiore accuratezza le proprietà della BBB specificamente ai capillari e continuare a svelare i segreti di questa affascinante e vitale struttura.
Spero che questo piccolo tuffo nel mondo della ricerca sulla BBB vi sia piaciuto! È un campo in continua evoluzione, e ogni piccolo progresso ci avvicina a comprendere meglio il nostro organo più complesso.

Fonte: Springer