Carne Coltivata: Come i Microcarrier Rivoluzionano la Produzione

Ciao a tutti! Oggi voglio parlarvi di qualcosa di davvero affascinante che sta cambiando il modo in cui pensiamo alla produzione di cibo: la carne coltivata. Nello specifico, voglio addentrarmi in come stiamo cercando di rendere questo processo più efficiente, più veloce e scalabile. La sfida è enorme: per avere un impatto reale, dobbiamo produrre quantità industriali di cellule muscolari (parliamo di trilioni di cellule!) in modo sostenibile. E qui entrano in gioco i protagonisti della nostra storia: i microcarrier (MCs).

Perché i Microcarrier sono la Svolta?

Immaginate i microcarrier come minuscole “isolette” sferiche su cui le cellule, in questo caso le cellule satelliti bovine (bSCs) che sono le progenitrici delle fibre muscolari, possono attaccarsi e crescere felici. Usarli è, al momento, il metodo più promettente per far crescere queste cellule, che per natura amano avere una superficie a cui aderire (sono cellule aderenti), su larga scala.

Quali sono i vantaggi?

• Superficie enorme in poco spazio: Hanno un rapporto superficie/volume altissimo. Pensate a quanta superficie di crescita possiamo stipare in un bioreattore!
• Compatibilità con i bioreattori: Possiamo usarli in diversi tipi di bioreattori (quelli agitati, a letto fisso, fluidizzato, ecc.), che sono essenziali per la produzione industriale.
• Il “passaparola” cellulare: Una delle cose più fighe è il fenomeno del “bead-to-bead transfer”. In pratica, le cellule sono capaci di migrare da un microcarrier all’altro spontaneamente. Questo è fantastico perché riduce al minimo la necessità di staccare le cellule con enzimi (un processo che può stressarle e causare perdite) quando vogliamo espandere la coltura. Possiamo semplicemente aggiungere nuovi MCs “vuoti” e lasciare che le cellule facciano il resto.

Il nostro obiettivo con questo studio era proprio quello di “intensificare” questo processo usando un terreno di coltura senza siero (un altro passo importante per la sostenibilità e i costi). Abbiamo esplorato come ottimizzare l’aggiunta di questi microcarrier per massimizzare la crescita cellulare all’interno dello stesso sistema, mantenendo le cellule in fase di crescita esponenziale.

Trovare il Punto Giusto: Densità Iniziale e Concentrazione di Microcarrier

Per prima cosa, ci siamo chiesti: quanta “terra” (concentrazione di MCs) dare alle nostre cellule e quante “coloni” (densità cellulare iniziale) mettere all’inizio? Abbiamo testato diverse concentrazioni di MCs, da 10 fino a 80 cm²/ml (che è parecchio!), e diverse densità di semina, da 1.000 a 4.750 cellule per cm² di superficie dei microcarrier.

I risultati? Sorprendentemente robusti! Abbiamo visto che le nostre bSCs crescevano bene in quasi tutte le condizioni testate, con un tempo medio di raddoppio tra le 40 e le 60 ore. Non abbiamo trovato differenze significative né in base alla concentrazione iniziale di MCs né alla densità di semina sulla velocità di crescita o sulla massima “densità abitativa” (confluenza) raggiunta sui microcarrier (circa 50.000 cellule/cm²).

Questo è interessante perché altri studi su tipi cellulari diversi avevano mostrato che alte concentrazioni di MCs o l’agitazione potevano stressare le cellule. Forse le nostre bSCs sono più resistenti alle forze idrodinamiche presenti nei bioreattori agitati, oppure il regime di agitazione che abbiamo scelto (necessario per tenere sospesi gli MCs anche alle concentrazioni più alte) ha mascherato eventuali effetti.

Un dato importante è che anche seminando poche cellule (1.000 cellule/cm², circa una cellula per microcarrier all’inizio) si ottengono buoni risultati. Questo ci dà molta flessibilità nel processo.

Obiettivo Massima Resa: Densità Cellulare e Fattore di Moltiplicazione

Ok, le cellule crescono bene in diverse condizioni, ma come massimizziamo la produzione? Abbiamo guardato due aspetti:

• Densità volumetrica: Quante cellule riusciamo a stipare per millilitro di coltura? Qui, come prevedibile, usare concentrazioni più alte di MCs porta a densità cellulari maggiori (fino a circa 3 milioni di cellule/ml con 60-80 cm²/ml di MCs). C’è un “ma”: a queste densità, le cellule consumano nutrienti e producono scarti a tutta velocità. Abbiamo notato l’esaurimento di alcuni amminoacidi e l’accumulo di lattato e ammoniaca. Questo, insieme a possibili stress idrodinamici maggiori (più collisioni tra MCs), potrebbe spiegare perché la crescita sembrava rallentare un po’ alle concentrazioni più alte. Serve ottimizzare l’alimentazione!
• Fattore di moltiplicazione (Fold Increase): Quante volte riusciamo a moltiplicare le cellule iniziali nello stesso “contenitore”? Qui la chiave è la densità di semina iniziale. Partendo con meno cellule per cm² (es. 1.000), otteniamo un fattore di moltiplicazione molto più alto (fino a 50 volte!) rispetto a partire con densità maggiori.

Combinando la possibilità di aumentare la concentrazione di MCs (da 10 a 80 cm²/ml, un fattore 8x) e di partire da bassa confluenza (fino a 50x), teoricamente potremmo ottenere un fattore di moltiplicazione totale di 400x nello stesso bioreattore! Questo è fondamentale per ridurre costi e ingombro degli impianti.

L’Arte di Aggiungere Microcarrier: Tempismo e Quantità Contano!

Finora abbiamo parlato di colture “statiche” in termini di MCs. Ma il bello viene quando iniziamo ad aggiungerne di nuovi per far continuare a crescere le cellule esponenzialmente. La domanda è: quando e quanti aggiungerne?

Abbiamo ipotizzato che la confluenza (quanto sono “piene” le isolette MCs) fosse il parametro chiave per decidere il momento giusto. E avevamo ragione! Aggiungere nuovi MCs quando quelli vecchi erano già molto pieni (>30.000 cellule/cm²) rallentava la crescita successiva. Probabilmente le cellule erano già un po’ “strette” (inibizione da contatto) e facevano fatica a migrare sui nuovi MCs prima di bloccarsi. Il momento ideale? Tra 15.000 e 25.000 cellule/cm². In questo range, la crescita ripartiva alla grande dopo l’aggiunta.

E quanti MCs aggiungere? Abbiamo testato diversi “rapporti di espansione” (quanti MCs nuovi aggiungiamo rispetto ai vecchi). Sorprendentemente, siamo riusciti ad usare un rapporto di espansione fino a 10 volte (cioè aggiungendo 10 volte la superficie iniziale di MCs) senza compromettere la velocità di crescita! Ovviamente, con un rapporto così alto, ci vuole un po’ più di tempo perché le cellule colonizzino tutti i nuovi MCs, ma funziona. Abbiamo anche visto che si possono fare multiple aggiunte (fino a 5 nel nostro studio) mantenendo la crescita esponenziale e raggiungendo sempre la confluenza massima.

Perché questo è importante? Usare un alto rapporto di espansione (come 10x) significa che potremmo aver bisogno di fare una sola aggiunta di MCs per massimizzare la capacità del nostro bioreattore, invece di tante piccole aggiunte. Meno interventi = meno rischi di contaminazione, meno lavoro, processo più semplice e intenso. Inoltre, ci permette di passare da un piccolo volume a uno molto più grande in pochi passaggi (es. da 1L a 15L, poi a 1000L con solo 2-3 passaggi), accelerando enormemente lo scale-up.

Dalla Provetta al Bioreattore: La Prova del Nove

Tutto bello in piccolo (usavamo spinner flask da 100 ml), ma funzionerà su scala più grande? Abbiamo fatto la prova trasferendo la nostra coltura ottimizzata in un bioreattore da 3 litri, usando la nostra strategia: aggiunta di MCs (con rapporto di espansione 7x) quando la confluenza era nel range ottimale (circa 17.000 cellule/cm²).

Il risultato? Successo! Le cellule hanno continuato a crescere esponenzialmente nel bioreattore da 3L con tempi di raddoppio simili a quelli visti negli spinner (~50 ore). Abbiamo raggiunto una confluenza finale ottima (circa 60.000 cellule/cm²). C’è stata una leggera differenza verso la fine, con le cellule nello spinner di controllo che crescevano un pelino più velocemente. Questo potrebbe dipendere dalle diverse condizioni idrodinamiche nel bioreattore più grande (forze maggiori), o dalla geometria diversa che influenza la sedimentazione degli MCs durante le fasi di agitazione intermittente usate per favorire il bead-to-bead transfer. Ma nel complesso, la strategia ha funzionato alla grande.

Alla fine, abbiamo anche testato il “raccolto”: staccare le cellule dai microcarrier. Abbiamo usato una tecnica combinata enzimatica e meccanica e siamo riusciti a recuperare praticamente tutte le cellule sia dal bioreattore che dallo spinner. E non solo: le cellule erano pure (>98% di bSCs) e mantenevano la loro capacità di differenziarsi in cellule muscolari mature (lo abbiamo verificato in 2D).

In Conclusione: Un Passo Avanti per la Carne del Futuro

Insomma, cosa ci portiamo a casa?

• Le cellule satelliti bovine sono delle ottime candidate per la produzione su microcarrier in terreno senza siero, mostrando grande robustezza.
• Possiamo partire con basse densità cellulari e usare un ampio range di concentrazioni di MCs.
• La confluenza cellulare (15.000-25.000 cellule/cm²) è un parametro chiave e affidabile per decidere quando aggiungere nuovi microcarrier.
• Possiamo usare rapporti di espansione dei microcarrier molto alti (fino a 10x), semplificando e intensificando il processo.
• La strategia funziona anche su scala più grande (bioreattore da 3L).

Questi risultati sono un tassello importante per rendere la produzione di carne coltivata più efficiente e scalabile. La strategia basata sulla confluenza per l’aggiunta di MCs potrebbe essere applicabile anche ad altri tipi di cellule aderenti, aprendo nuove strade nell’ingegneria tissutale e nella bioproduzione. La strada è ancora lunga, ma ogni passo ci avvicina a un futuro con alternative proteiche più sostenibili!

Fonte: Springer