Benzossazoli: Nuovi Eroi Contro Depressione e Parkinson? La Mia Caccia agli Enzimi MAO!

Amici scienziati e curiosi di ogni sorta, oggi vi porto con me in un viaggio affascinante nel mondo della biochimica e della farmacologia. Parleremo di nemici invisibili che si annidano nel nostro cervello, gli enzimi monoamino ossidasi (MAO), e di come una nuova classe di composti, i derivati del 2-metilbenzo[d]ossazolo, potrebbe darci nuove armi per combatterli. Preparatevi, perché la storia è di quelle che tengono col fiato sospeso!

Gli Enzimi MAO: Registi Occulti del Nostro Umore (e Non Solo)

Immaginate il nostro cervello come una complessa orchestra, dove i neurotrasmettitori sono i musicisti che suonano la sinfonia del nostro umore, dei nostri pensieri e movimenti. Gli enzimi MAO, presenti in due versioni – MAO-A e MAO-B – sono un po’ come dei direttori d’orchestra un po’ troppo zelanti, che a volte “spengono” i musicisti (cioè metabolizzano i neurotrasmettitori) prima del tempo. Questi enzimi si trovano un po’ ovunque nel nostro corpo, dal sistema digestivo a quello neurologico, e hanno un ruolo cruciale.

La MAO-A preferisce “zittire” neurotrasmettitori come la serotonina, mentre la MAO-B si concentra su amine più piccole come la 2-feniletilamina. Altri, come la dopamina, l’epinefrina e la norepinefrina, non sfuggono a nessuna delle due. Capite bene che se questi enzimi lavorano troppo o troppo poco, l’equilibrio salta. Non a caso, sono bersagli farmacologici noti da decenni per trattare disturbi come la depressione (principalmente con inibitori della MAO-A) e il morbo di Parkinson (con inibitori della MAO-B).

Nel caso della depressione, si è visto che i livelli di MAO-A sono spesso elevati nel cervello dei pazienti. Bloccando questo enzima, si aumentano i livelli di serotonina, norepinefrina e dopamina, con un effetto antidepressivo. Per il Parkinson, caratterizzato da una carenza di dopamina, gli inibitori della MAO-B come la selegilina e la rasagilina aiutano a preservare la dopamina esistente, alleviando i sintomi e, forse, rallentando la progressione della malattia. Questo potenziale effetto neuroprotettivo è legato anche alla riduzione dello stress ossidativo, dato che le MAO producono perossido di idrogeno, una sostanza che può danneggiare i neuroni.

Ma non finisce qui! Le MAO sono state collegate anche a malattie cardiache (la MAO-A nel cuore può causare danni mitocondriali) e persino al cancro alla prostata, dove un’aumentata espressione di MAO-A sembra favorirne la progressione. Insomma, tenere a bada questi enzimi è fondamentale, e la ricerca di nuovi inibitori, più potenti e selettivi, è un campo sempre caldo sia nel mondo accademico che nell’industria farmaceutica.

La Mia Scommessa: i Derivati del 2-Metilbenzo[d]ossazolo

Da dove partire per scovare nuovi campioni? Un approccio classico, e spesso vincente, è quello di prendere spunto da molecole già note per la loro attività. Ed è qui che entrano in gioco i nostri protagonisti: una serie di tredici derivati del 2-metilbenzo[d]ossazolo (chiamiamoli 1a–f e 2a–g per comodità). Perché proprio loro? Beh, il nucleo benzossazolico è una vecchia conoscenza nel mondo farmaceutico, presente in molti farmaci commercializzati e in composti sperimentali con attività biologica interessante. Inoltre, questi nuovi derivati presentano alcune caratteristiche strutturali che ricordano da vicino altri inibitori MAO noti.

Ad esempio, molti di essi portano una catena laterale benzilossidica. Questa particolare “coda” è presente in numerosi inibitori MAO sperimentali e, cosa importantissima, nel farmaco safinamide, un inibitore specifico della MAO-B. Quando la safinamide si lega alla MAO-B, questa porzione benzilossidica si estende nella cavità d’ingresso dell’enzima, stabilizzandosi grazie a interazioni di van der Waals. Anche il nucleo benzossazolico in sé ha mostrato di poter dare origine a potenti e specifici inibitori della MAO-B, come il composto 3 menzionato nello studio originale (con una IC50 di 0.103 µM). Gli atomi di ossigeno e azoto nella struttura benzossazolica potrebbero fungere da accettori di legami a idrogeno nelle regioni polari del sito attivo delle MAO, vicino al cofattore flavin adenina dinucleotide (FAD).

L’idea, quindi, era di combinare questi elementi promettenti. Abbiamo sintetizzato questi tredici composti partendo da due mattoni fondamentali, il 2-metilbenzo[d]ossazol-6-olo e il 2-metilbenzo[d]ossazol-5-olo, facendoli reagire con bromuri benzilici opportunamente sostituiti. Questo ci ha permesso di ottenere derivati con la “coda” benzilossidica attaccata in posizione C5 o C6 dell’anello benzossazolico. La sintesi è andata liscia, con purezze e rese variabili ma generalmente buone. Abbiamo anche confermato la struttura di uno dei composti (2b) tramite cristallografia a raggi X, giusto per essere sicuri di dove avevamo attaccato i vari pezzi!

I Risultati del Test: Chi Ha Vinto la Sfida Contro le MAO?

Una volta ottenuti i nostri campioni, è arrivato il momento della verità: testare la loro capacità di inibire le MAO-A e MAO-B umane ricombinanti. Abbiamo usato la chinuramina come substrato, la cui ossidazione da parte delle MAO produce un composto fluorescente, la 4-idrossichinolina. Misurando questa fluorescenza, potevamo quantificare l’attività enzimatica in presenza e assenza dei nostri inibitori, calcolando così le famose IC50 (la concentrazione di inibitore che dimezza l’attività enzimatica). Più bassa è la IC50, più potente è l’inibitore. Tenetevi forte, perché i risultati sono stati entusiasmanti!

Focus sulla MAO-A: Sorprese e Conferme

Per quanto riguarda la MAO-A, i campioni d’onore sono stati 2c (IC50 = 0.670 µM) e 2e (IC50 = 0.592 µM). Questi due si sono dimostrati significativamente più potenti del nostro inibitore di riferimento, il toloxatone (IC50 = 1.67 µM). Entrambi avevano la catena benzilossidica in posizione C5. I loro “cugini” con la sostituzione in C6 (1c e 1e) erano un po’ meno potenti, ma comunque buoni inibitori. Curiosamente, i composti meno attivi contro la MAO-A sono stati 2a e 2f, anch’essi sostituiti in C5. Questo ci ha suggerito che nessuna delle due posizioni (C5 o C6) fosse universalmente preferita per l’inibizione della MAO-A. Non è emerso un trend chiarissimo nemmeno per l’effetto del sostituente sull’anello benzilossidico: per la serie C6, il composto nitro (1d) era il più potente, mentre per la serie C5 era il cloro-derivato (2e). In generale, però, i composti non sostituiti (1a, 2a) e quelli metil-sostituiti (1f, 2f) erano i più deboli in entrambe le serie. Sembra che la presenza di alogeni (Cl, Br), gruppi nitrilici o nitro fosse vantaggiosa.

Focus sulla MAO-B: Un Trionfo!

Ma è sull’inibizione della MAO-B che i nostri derivati hanno davvero brillato! Tutti i composti testati sono risultati potenti inibitori della MAO-B, con valori di IC50 nell’ordine dei sottomicromolari. I campioni di razza sono stati 1d (IC50 = 0.0023 µM), 2e (IC50 = 0.0033 µM), 1e (IC50 = 0.0042 µM), 2c (IC50 = 0.0056 µM) e 2b (IC50 = 0.0057 µM). Parliamo di potenze significativamente superiori a quelle della safinamide (IC50 = 0.240 µM), il nostro riferimento! Questo significa che i nostri derivati del 2-metilbenzo[d]ossazolo erano inibitori specifici per l’isoforma MAO-B, con un indice di selettività (SI) maggiore di 83 per la maggior parte di essi. Un’eccezione è stata 2g, con un SI di 4, il meno selettivo della serie.

Anche qui, i composti cloro-sostituiti (1e, 2e) erano tra i più potenti. E, come per la MAO-A, i composti non sostituiti e quelli metilati erano tra i più deboli. Un dato interessante è emerso con il composto 2g, che portava un gruppo nitrile in posizione meta sull’anello benzilossidico: è risultato il più debole inibitore MAO-B della serie (IC50 = 0.387 µM). Al contrario, il suo omologo con il nitrile in posizione para (2c) era potentissimo. Questo suggerisce che la sostituzione in meta fosse meno ottimale, probabilmente a causa di un ingombro sterico sfavorevole nel sito attivo della MAO-B. Il composto 2f, invece, si è distinto per una specificità particolarmente elevata per la MAO-B, con un SI di ben 1308!

Dentro l’Enzima: Come Funzionano? Gli Studi di Docking

Per capire meglio come questi composti interagissero con i loro bersagli a livello molecolare, abbiamo eseguito degli esperimenti di docking molecolare. È un po’ come usare un supercomputer per simulare come una chiave (il nostro inibitore) si inserisce in una serratura (il sito attivo dell’enzima). Abbiamo usato le strutture cristallografiche note della MAO-A e della MAO-B.

Prendiamo ad esempio il composto 2e, un potente inibitore di entrambe le isoforme. Nel sito attivo della MAO-A, il suo nucleo 2-metilbenzo[d]ossazolo si posizionava vicino al cofattore FAD, mentre la catena benzilossidica si proiettava verso l’ingresso del sito attivo. Abbiamo predetto un legame a idrogeno con una molecola d’acqua del sito attivo e interazioni di van der Waals con diversi residui amminoacidici. L’energia di interazione totale era di –29.7 kcal/mol.

Quando abbiamo “dockato” 2e nella MAO-B, l’orientamento era simile: il nucleo benzossazolico vicino al FAD e la catena benzilossidica che si estendeva nella cavità d’ingresso, oltrepassando un residuo “guardiano” (Ile199). Qui non abbiamo osservato legami a idrogeno diretti, ma diverse interazioni pi-greco tra l’anello a cinque membri del benzossazolo e Tyr398, e tra il fenile benzilossidico e Ile199. Le interazioni di van der Waals con residui come Leu171, Ile199, Gln206 e Tyr326 contribuivano in modo significativo. L’energia di interazione totale era di –39.6 kcal/mol, un valore più negativo rispetto a quello con MAO-A, il che è in linea con la sua maggiore potenza inibitoria verso MAO-B.

E per quanto riguarda 2g, il più debole inibitore MAO-B? Il docking ha mostrato che si legava in modo simile a 2e, con un’energia di interazione simile (–38.7 kcal/mol). La differenza principale sembrava risiedere nel fatto che il sostituente in para di 2e si spingeva più in profondità nella cavità d’ingresso, interagendo più efficacemente con alcuni residui (Pro102, Phe103, Trp119) rispetto al sostituente in meta di 2g. Questo potrebbe spiegare, almeno in parte, la sua minore potenza.

Conclusioni e Prospettive Future: Una Nuova Speranza?

Cosa ci portiamo a casa da questa avventura? Beh, direi un bel po’ di soddisfazione! Abbiamo dimostrato che i derivati del 2-metilbenzo[d]ossazolo sono una classe di potenti e specifici inibitori della MAO-B, con alcuni composti (come 2e e 2c) che mostrano anche una buona attività contro la MAO-A. Questi risultati sono molto promettenti e suggeriscono che queste molecole potrebbero essere degli ottimi “lead compounds”, cioè dei prototipi da cui partire per sviluppare farmaci clinicamente utili per disturbi come la depressione, il Parkinson e, chissà, forse anche l’Alzheimer.

Una caratteristica notevole è l’elevata potenza verso la MAO-B (IC50 < 0.036 µM) mostrata da molti omologhi, sia quelli non sostituiti sull'anello benzilico fenilico sia quelli con sostituenti in posizione para. Questo è fantastico, perché significa che possiamo tollerare diverse modifiche in quella posizione senza perdere troppa potenza, il che è utilissimo se dobbiamo, ad esempio, migliorare le proprietà farmacocinetiche di una molecola (come viene assorbita, distribuita, metabolizzata ed eliminata dal corpo).

È importante sottolineare che i nostri derivati si sono dimostrati significativamente più potenti, in vitro, della safinamide come inibitori della MAO-B. Certo, inibiscono anche la MAO-A, quindi non sono “assolutamente” specifici per la MAO-B. Ma questo profilo farmacologico potrebbe rivelarsi un vantaggio in certe situazioni, ad esempio nel trattamento del Parkinson quando è presente anche depressione come comorbidità, dove un’inibizione di entrambe le isoforme potrebbe essere benefica.

La strada è ancora lunga, ovviamente. Questi sono studi in vitro, e bisognerà passare a test più complessi. Ma i primi passi sono stati decisamente incoraggianti. Chissà, forse un giorno uno di questi piccoli derivati del benzossazolo diventerà un grande aiuto per molti pazienti. E io sarò felice di aver contribuito, anche solo un pochino, a questa caccia grossa nel mondo degli enzimi!

Fonte: Springer