Inclusioni di Huntingtina: Non Sono Tutte Uguali! Scopriamo i Loro Segreti nel Cervello Umano

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel cuore di una malattia neurodegenerativa complessa: la Malattia di Huntington (HD). Come sapete, è una condizione ereditaria causata da una mutazione nel gene che codifica per la proteina huntingtina (HTT). Uno dei segni distintivi di questa malattia, visibile al microscopio nel tessuto cerebrale dei pazienti, è l’accumulo di aggregati di questa proteina, che chiamiamo corpi inclusi di huntingtina.

Per anni, abbiamo pensato a questi aggregati come a un “nemico” unico da combattere, un bersaglio per le terapie. Ma, diciamocelo, i trattamenti mirati direttamente alla proteina HTT non hanno avuto l’efficacia sperata. Questo ci ha fatto pensare: e se questi corpi inclusi non fossero tutti uguali? E se capirne le differenze fosse la chiave per sbloccare nuove strategie terapeutiche?

La Sfida: Capire la Diversità degli Aggregati

Il problema principale è stato, per molto tempo, la limitatezza degli strumenti a nostra disposizione, in particolare gli anticorpi usati per “vedere” e studiare la proteina HTT nel cervello umano. Gli anticorpi più comuni (come 1C2, 1F8, S830 ed EM48) hanno i loro limiti, e data la diversità biochimica e strutturale di questi aggregati, è improbabile che un singolo anticorpo possa riconoscerli tutti. È un po’ come cercare di descrivere una folla variegata usando un solo identikit!

Recentemente, abbiamo notato che anticorpi diversi, che si legano a punti diversi (epitopi) della proteina HTT, mostravano schemi di marcatura differenti nel cervello HD. Tre anticorpi disponibili commercialmente, EM48, EPR5526 e MW1, si sono rivelati capaci di marcare i corpi inclusi, ma ognuno ne “vedeva” un numero diverso. La domanda era: stanno identificando inclusioni completamente distinte, o inclusioni con caratteristiche in parte sovrapposte?

La Nostra Indagine: Smascherare gli Immunofenotipi

È qui che entra in gioco il nostro studio. Abbiamo deciso di usare una tecnica avanzata chiamata immunoistochimica multiplex. Immaginate di poter usare contemporaneamente diversi “evidenziatori” fluorescenti (i nostri anticorpi) sulla stessa fettina di tessuto cerebrale. Questo ci ha permesso di vedere quali inclusioni venivano riconosciute da EM48, quali da EPR, quali da MW1, e quali da combinazioni di questi anticorpi. Abbiamo chiamato questi diversi profili di marcatura “immunofenotipi“.

Abbiamo analizzato campioni di corteccia cerebrale (specificamente il giro temporale medio, un’area coinvolta nell’HD) provenienti da 28 pazienti con HD e 27 controlli neurologicamente normali. E i risultati sono stati sorprendenti!

Risultati Sorprendenti: Un Mosaico di Inclusioni

Abbiamo confermato che nel cervello HD c’è un aumento significativo di inclusioni marcate da EM48, EPR e MW1 rispetto ai controlli. Ma la vera scoperta è stata la varietà degli immunofenotipi:

• La maggior parte delle inclusioni (circa il 56%) era marcata solo da EM48.
• Seguivano quelle marcate solo da MW1 (circa 14%) e solo da EPR (circa 12%).
• Una percentuale minore mostrava una co-marcatura: EM48+EPR+ (11%), EM48+EPR+MW1+ (4%), EM48+MW1+ (1%), EPR+MW1+ (meno dell’1%).

In pratica, oltre l’80% delle inclusioni veniva riconosciuto da un solo tipo di anticorpo! Questo ci dice chiaramente che la composizione e/o la struttura di questi aggregati è estremamente eterogenea.

Immunofenotipi e Gravità della Malattia: Un Legame Interessante

Abbiamo poi cercato di capire se questi diversi immunofenotipi avessero un significato clinico. Abbiamo confrontato la proporzione dei vari tipi di inclusioni in pazienti con diverse caratteristiche della malattia: lunghezza della ripetizione CAG (il difetto genetico), età di esordio dei sintomi e grado di Vonsattel (una misura della gravità del danno cerebrale).

È emerso un quadro intrigante: le inclusioni marcate solo da EM48 erano proporzionalmente più abbondanti nei casi con:

• Maggiore lunghezza della ripetizione CAG (>43)
• Età di esordio più precoce (≤ 40 anni)
• Gradi di Vonsattel più avanzati (3-4)

Al contrario, le inclusioni marcate solo da MW1 o da tutti e tre gli anticorpi (EM48+EPR+MW1+) erano relativamente meno abbondanti in questi gruppi più gravi. Questo suggerisce che l’accumulo specifico delle inclusioni EM48+ potrebbe essere legato alla progressione e alla severità della malattia.

Caratteristiche Distintive: Dimensioni e Posizione

Ma non ci siamo fermati qui. Volevamo capire meglio le caratteristiche fisiche di questi diversi tipi di inclusioni.
Abbiamo misurato le loro dimensioni:

• Le inclusioni marcate solo da un anticorpo (EM48+, EPR+, MW1+) erano generalmente più piccole.
• Le inclusioni marcate da due o più anticorpi erano significativamente più grandi. In particolare, quelle positive per EPR e MW1 tendevano ad essere più grandi.

E la loro posizione all’interno o all’esterno del nucleo cellulare:

• Le inclusioni EM48+ erano significativamente meno probabili di trovarsi all’interno del nucleo rispetto a quelle EM48-.
• Al contrario, le inclusioni EPR+ e MW1+ erano significativamente più probabili di essere nucleari.
• In particolare, le inclusioni marcate solo da EM48 erano prevalentemente non-nucleari (cioè nel citoplasma o nel neuropilo), a differenza di quasi tutti gli altri tipi.

Quindi, le inclusioni EM48+ only, quelle associate alla maggiore gravità, sembrano essere piccole e preferenzialmente localizzate fuori dal nucleo.

Il Ruolo dell’Ubiquitinazione: Il Sistema di “Smaltimento” Cellulare

Un’altra domanda cruciale era: come cerca la cellula di gestire questi aggregati? Uno dei meccanismi principali è l’ubiquitinazione, un processo in cui le proteine da eliminare vengono “etichettate” con molecole di ubiquitina. Esistono diversi tipi di “catene” di ubiquitina, che indirizzano la proteina verso destini diversi:

• Le catene legate in K48 indirizzano principalmente al proteasoma (una sorta di “trita-documenti” cellulare).
• Le catene legate in K63 promuovono l’aggregazione e indirizzano principalmente all’autofagia (un processo in cui la cellula “mangia” parti di sé stessa, inclusi aggregati e organelli danneggiati).

Cosa abbiamo scoperto sull’ubiquitinazione delle inclusioni di HTT?

• Circa il 60% di tutte le inclusioni era ubiquitinato.
• Le inclusioni marcate da due o più anticorpi (quelle più grandi) erano più frequentemente ubiquitinate rispetto a quelle marcate da un solo anticorpo (come le EM48+ only).
• Tra le inclusioni ubiquitinate, la stragrande maggioranza (circa l’80%) era marcata per l’ubiquitina legata in K63, piuttosto che in K48 (circa 20%). Questo valeva per quasi tutti gli immunofenotipi.

Questo forte segnale K63 suggerisce che la cellula tenta preferenzialmente di eliminare le inclusioni più grandi e complesse attraverso l’autofagia. Il fatto che le piccole inclusioni EM48+ only siano meno ubiquitinate potrebbe indicare che sfuggono a questo sistema di controllo qualità, o che rappresentano una forma diversa che la cellula non riconosce o non riesce a processare efficacemente.

Proteine “Triage”: Ubiquilina 2 e p62

L’ubiquitinazione è solo il primo passo. Proteine chiamate “triage” (come ubiquilina 2 e p62) riconoscono le etichette di ubiquitina e aiutano a trasportare il carico verso il proteasoma o l’autofagia. Abbiamo quindi verificato se queste proteine fossero associate alle nostre inclusioni ubiquitinate.

I risultati:

• Le inclusioni ubiquitinate erano significativamente più immunoreattive per ubiquilina 2 che per p62.
• Ancora una volta, le inclusioni marcate da due o più anticorpi mostravano una maggiore associazione sia con ubiquilina 2 che con p62 rispetto a quelle marcate da un solo anticorpo.
• L’associazione più forte con ubiquilina 2 (rispetto a p62) era particolarmente evidente per alcuni fenotipi multi-marcati.

Questo rafforza l’idea che le inclusioni più complesse vengano riconosciute dal sistema di degradazione cellulare, con un possibile ruolo predominante per i percorsi che coinvolgono ubiquilina 2, che può interagire sia con il proteasoma che con l’autofagia.

Un Quadro Complessivo: Ogni Inclusione Ha la Sua Storia

Mettendo insieme tutti i pezzi – immunofenotipo, dimensioni, localizzazione, ubiquitinazione e proteine triage – emerge un quadro affascinante e complesso (che abbiamo riassunto in una sorta di “mappa termica” visiva). Ogni immunofenotipo sembra avere una sua “firma” molecolare distintiva:

• Inclusioni EM48+ only: Piccole, prevalentemente non-nucleari, meno ubiquitinate, associate a malattia più severa. Forse una forma che sfugge ai controlli o particolarmente problematica?
• Inclusioni multi-marcate (es. EM48+EPR+MW1+): Grandi, più frequentemente ubiquitinate (soprattutto K63), associate a ubiquilina 2 e p62. Rappresentano forse aggregati più “maturi” che la cellula sta attivamente cercando di eliminare tramite autofagia?
• Altri fenotipi (es. EPR+MW1+): Mostrano caratteristiche intermedie o uniche, come una localizzazione prevalentemente nucleare.

La nostra ipotesi (vedi Fig. 6C nell’articolo originale) è che questi diversi tipi di inclusioni possano rappresentare stadi diversi di formazione o avere ruoli diversi nella progressione della malattia. Le piccole inclusioni EM48+ potrebbero formarsi presto o essere particolarmente resistenti alla degradazione, contribuendo alla tossicità, mentre quelle più grandi e multi-marcate potrebbero essere il risultato di un tentativo (forse inefficiente nell’HD avanzata) della cellula di sequestrare e degradare la proteina anomala.

Cosa Significa Tutto Questo per il Futuro?

Questa ricerca ci insegna una lezione fondamentale: i corpi inclusi di huntingtina non sono tutti uguali. La loro diversità in termini di composizione, struttura, localizzazione e interazione con i sistemi di controllo qualità cellulare è enorme.

Questo ha implicazioni importanti:

1. Per la ricerca: Non possiamo più studiare la patologia HTT trattando tutti gli aggregati allo stesso modo. Dobbiamo usare una combinazione di anticorpi per catturare l’intero spettro della patologia e correlare specifici tipi di inclusioni con la neurodegenerazione e i sintomi clinici.
2. Per le terapie: Le strategie terapeutiche future, specialmente quelle basate su anticorpi, dovranno tenere conto di questa eterogeneità. Potrebbe essere necessario sviluppare approcci mirati a specifici tipi di inclusioni o a potenziare i meccanismi di degradazione che sembrano essere attivi (come l’autofagia K63-dipendente).

C’è ancora molta strada da fare, ovviamente. Dobbiamo capire meglio le conseguenze funzionali di questi diversi tipi di inclusioni usando modelli cellulari e animali. Ma credo che aver messo in luce questa sorprendente diversità sia un passo avanti cruciale per comprendere più a fondo la Malattia di Huntington e, speriamo, per sviluppare terapie più efficaci. È un campo di ricerca in continua evoluzione, ed è emozionante farne parte!

Fonte: Springer