DNA sulla Scena del Crimine: Quanti Eravate Davvero? Il Dilemma dei Contributori Nascosti

Ciao a tutti! Immaginatevi sulla scena di un crimine, o meglio, nel laboratorio di genetica forense dove arrivano campioni biologici complessi. Spesso non troviamo una singola, pulita traccia di DNA, ma un miscuglio, un vero e proprio “cocktail genetico” lasciato da più persone. Qui inizia il bello, o meglio, la sfida: capire chi ha contribuito a quel miscuglio. E, ancora prima, quanti erano i “cuochi” di questa ricetta genetica. Sembra un dettaglio, vero? Invece, come ho scoperto approfondendo uno studio recente, stimare correttamente il Numero di Contributori (NoC) è un passaggio cruciale che può cambiare radicalmente le sorti di un’indagine.

Il Cuore del Problema: Il Numero di Contributori (NoC)

Parliamoci chiaro: quando analizziamo campioni di DNA misto, il primo grattacapo per noi esperti è proprio stabilire questo famoso NoC. Non è un numero che salta fuori magicamente dall’elettroferogramma (il grafico che visualizza il profilo DNA). Anzi, è un’incognita nella maggior parte dei casi reali. Perché è così difficile? Beh, i motivi sono tanti:

• Condivisione di alleli: Persone diverse possono avere varianti genetiche (alleli) in comune, confondendo le acque.
• Contributi sproporzionati: Un individuo potrebbe aver lasciato molto più DNA di un altro, mascherando il contributo minore.
• Picchi “stutter”: Artefatti tecnici della PCR che possono essere scambiati per veri alleli di un contributore minoritario (o viceversa).
• Effetti stocastici: Se il DNA è scarso o degradato, possono verificarsi fenomeni come la perdita di alleli (drop-out) o la comparsa di alleli “fantasma” (drop-in), rendendo l’interpretazione un vero rompicapo.

La stima del NoC, quindi, si basa sull’esperienza dell’analista, sulla sua capacità di distinguere i segnali reali dal “rumore di fondo”. Un metodo comune è il Maximum Allele Count (MAC), che conta il massimo numero di alleli osservati in un singolo marcatore genetico e ne deduce un NoC minimo. Ma capite bene che c’è un margine di soggettività e, quindi, di potenziale errore. E se sbagliamo il NoC, cosa succede quando andiamo a calcolare il peso statistico della prova, il famoso Likelihood Ratio (LR), che ci dice quanto è più probabile osservare quel profilo genetico se il sospettato è un contributore rispetto a se non lo è?

Mettere alla Prova la Stima: Il Nostro Studio su Casi Reali

Proprio per rispondere a questa domanda, è stato condotto uno studio affascinante, che ho avuto modo di analizzare a fondo. Invece di usare campioni “finti” creati in laboratorio (i cosiddetti mock samples), dove il NoC è noto a priori, si è deciso di affrontare la complessità del mondo reale, utilizzando 152 campioni provenienti da veri casi giudiziari. Un bel tuffo nella realtà quotidiana dei laboratori forensi! Per ogni campione misto, un esperto ha stimato il NoC (chiamiamolo eNoC, che poteva essere 2 o 3). Poi, abbiamo fatto finta di aver sbagliato questa stima, analizzando gli stessi campioni ipotizzando un NoC maggiore (eNoC+1) o minore (eNoC-1, solo per i casi con eNoC=3).

Per calcolare l’LR, sono stati usati tre diversi software di genotipizzazione probabilistica, strumenti ormai indispensabili:

• LRmix Studio: Un software “qualitativo”, che considera solo la presenza/assenza degli alleli.
• EuroForMix e STRmix™: Software “quantitativi”, che tengono conto anche dell’altezza dei picchi nell’elettroferogramma, un’informazione preziosa sulla quantità di DNA.

L’obiettivo era confrontare, all’interno di ciascun software, come cambiava l’LR quando si variava il NoC. Questo per assicurarci che le differenze osservate fossero dovute proprio alla variazione del NoC e non alle diverse architetture statistiche dei programmi.

I campioni genetici analizzati comprendevano un set di 21 marcatori STR autosomici. Per ogni coppia campione misto/campione di riferimento (del sospettato, o Persona di Interesse – PoI), si calcolava l’LR sotto due ipotesi: “Il PoI è un contributore della mistura” versus “Il PoI non è imparentato con alcun contributore della mistura”.

Software a Confronto: Reazioni Diverse alla Variazione del NoC

Ora, la parte succosa: come hanno reagito i diversi software? Beh, le risposte non sono state univoche, il che già ci dice molto sulla complessità della faccenda.

Quando si sovrastimava il NoC (cioè NoC = eNoC+1):

• Con LRmix Studio e STRmix™, si è osservata una tendenza statisticamente significativa a ottenere valori di LR più bassi. Questo ha senso: se ipotizzo più contributori, aumento il numero di combinazioni genotipiche possibili che spiegano la mistura, “diluendo” un po’ il peso della prova a carico del PoI.
• Con EuroForMix, invece, si è vista la tendenza opposta: LR tendenzialmente più alti. È interessante notare, però, che EuroForMix è stato il software con la maggior proporzione di casi in cui la variazione dell’LR era inferiore a un ordine di grandezza, suggerendo un impatto pratico modesto in molti scenari di sovrastima.

Le discrepanze più eclatanti, con LR che variavano di oltre 10.000 volte, sono state trovate solo con STRmix™, sia per misture stimate a 2 che a 3 contributori. Bisogna però considerare la natura stocastica di STRmix™ (basato su metodi MCMC): a volte queste grandi variazioni potrebbero essere dovute a una mancata convergenza dell’algoritmo piuttosto che solo alla variazione del NoC.

E quando si sottostimava il NoC (cioè NoC = eNoC-1, applicato solo a misture con eNoC=3, analizzandole come se fossero a 2 contributori)? Qui le cose si sono fatte ancora più serie.

• Per LRmix Studio, non c’è stata una tendenza chiara di aumento o diminuzione dell’LR.
• Per STRmix™, la situazione è stata drastica: nell’87% dei casi, il software non è riuscito a “conciliare” il NoC sottostimato con i dati genetici, o dando un errore o un LR nullo. Questo ci dice che STRmix™ è molto “rigido” e fatica ad accettare un NoC che non spiega adeguatamente la complessità del profilo. Nei pochi casi in cui ha dato un risultato, non c’era una tendenza chiara.
• EuroForMix è stato l’unico a mostrare una tendenza statisticamente significativa: l’LR diminuiva. Questo potrebbe accadere perché il software, per far “quadrare i conti” con un NoC troppo basso, potrebbe interpretare alleli reali del PoI (magari a bassa intensità) come stutter o artefatti, indebolendo la prova. In alcuni casi, l’LR è sceso sotto 1, supportando l’ipotesi che il PoI non fosse un contributore!

In generale, l’impatto di considerare un NoC inferiore a quello stimato dall’esperto (eNoC-1) è sembrato maggiore e più problematico per tutti i software, specialmente per quelli quantitativi.

Sottostimare è Peggio? L’Impatto Maggiore della Sottovalutazione

Una delle scoperte più interessanti e, per certi versi, preoccupanti, è che, in generale, sbagliare per difetto – cioè sottostimare il numero di contributori – sembra avere conseguenze più pesanti sull’interpretazione statistica rispetto a sbagliare per eccesso. Quando diciamo al software che ci sono meno contributori di quelli che potrebbero esserci realmente (o che comunque spiegherebbero meglio il profilo), lo mettiamo in difficoltà. Il software potrebbe non riuscire a giustificare tutti i picchi allelici presenti, portando a LR molto bassi, o addirittura a conclusioni errate, come escludere un vero contributore.

Pensateci: se ci sono, poniamo, tre persone che hanno lasciato il loro DNA, ma noi diciamo al software che sono solo due, il programma farà i salti mortali per far rientrare tutti quegli alleli in soli due profili. Potrebbe considerare alcuni alleli del terzo, vero contributore, come artefatti, o semplicemente non riuscire a trovare una combinazione plausibile, portando a un LR che non riflette la realtà. Questo è particolarmente vero per i software quantitativi, che cercano di modellare anche le altezze dei picchi. STRmix™, come abbiamo visto, in molti casi “getta la spugna”, segnalando un’incompatibilità. EuroForMix, pur essendo più “tollerante” e cercando di assegnare comunque un LR, può finire per sottovalutare significativamente la forza della prova.

Le Implicazioni Pratiche: Perché Tutto Questo Ci Interessa?

Ma alla fine della fiera, perché dovremmo preoccuparci di questi tecnicismi? Beh, perché l’interpretazione del DNA forense ha un impatto diretto sull’amministrazione della giustizia. Un LR calcolato in modo errato a causa di una stima sbagliata del NoC può portare a conclusioni fuorvianti, con conseguenze potenzialmente gravi: un colpevole potrebbe essere scagionato, o, peggio ancora in termini di errore giudiziario, un innocente potrebbe essere ingiustamente associato a un crimine.

Questo studio, utilizzando dati reali con tutte le loro imperfezioni e complessità – quelle che non si possono replicare facilmente con campioni finti – sottolinea in modo potente quanto sia ancora fondamentale il ruolo dell’esperto forense. I software sono strumenti potentissimi, ma non sono una bacchetta magica. L’input che forniamo, come la stima del NoC, è cruciale. Dobbiamo essere consapevoli dei limiti, delle sensibilità dei diversi modelli computazionali e dell’impatto che le nostre valutazioni preliminari possono avere sul risultato finale.

Certo, ci sono delle limitazioni anche in questo studio. Ad esempio, non si sono inclusi LR per i non-contributori, e data la natura dei campioni reali, non si può mai essere sicuri al 100% del vero NoC o se il profilo di riferimento abbia effettivamente contribuito. Tuttavia, il suo valore aggiunto sta proprio nell’aver affrontato la “giungla” dei casi reali.

Un Monito per il Futuro della Genetica Forense

Quindi, cosa ci portiamo a casa da tutto questo? Che la stima del numero di contributori in una mistura di DNA non è un dettaglio trascurabile, ma un pilastro su cui si regge l’intera interpretazione statistica. Sbagliare questa stima, soprattutto sottovalutandola, può avere implicazioni profonde sul peso della prova. I diversi software reagiscono in modo differente, e quelli quantitativi sembrano essere particolarmente sensibili a queste variazioni.

Questo lavoro ci ricorda l’importanza di un’analisi critica e consapevole, e la necessità di continuare la ricerca per sviluppare metodi sempre più robusti e affidabili per affrontare le sfide poste dai campioni di DNA complessi. Perché dietro ogni calcolo, dietro ogni LR, c’è la ricerca della verità e la responsabilità di fornire un contributo solido e scientificamente fondato alla giustizia.

Fonte: Springer