HSPB7: Il Regista Inaspettato della Dimerizzazione di Filamina C nel Muscolo Cardiaco

Ciao a tutti! Oggi voglio portarvi con me in un viaggio affascinante nel cuore pulsante delle nostre cellule muscolari, in particolare quelle cardiache. Parleremo di come le proteine interagiscono, si regolano a vicenda e mantengono tutto in ordine, un balletto molecolare fondamentale per la nostra salute. Al centro della scena ci sono due protagonisti: Filamina C (FLNC) e HSPB7.

Filamina C: Un Pilastro Multifunzionale Sotto Stress

Immaginate Filamina C come un componente cruciale dell’impalcatura interna delle cellule muscolari striate (quelle del cuore e dei muscoli scheletrici). È una proteina legante l’actina, essenziale per dare struttura e resistenza meccanica. Ma non è solo un mattone passivo! FLNC è anche una piattaforma di segnalazione, interagisce con un sacco di altre proteine e gioca un ruolo chiave nella risposta cellulare allo stress meccanico, come quello continuo a cui è sottoposto il nostro cuore che batte senza sosta.

Pensate che varianti genetiche di FLNC sono associate a diverse patologie, dalle cardiomiopatie (malattie del muscolo cardiaco) alle miopatie muscoloscheletriche. Questo ci fa capire quanto sia vitale il suo corretto funzionamento. Una delle sue caratteristiche chiave è la capacità di formare omodimeri, cioè coppie di due molecole di FLNC identiche. Questa dimerizzazione, che avviene nella sua parte terminale (il dominio d24), è necessaria perché FLNC possa “incrociare” i filamenti di actina, creando una rete robusta. Se questa capacità di dimerizzare viene meno, sono guai seri.

HSPB7: Un Chaperone Molecolare Atipico

E poi c’è HSPB7, una proteina chaperone molecolare specifica del cuore e del muscolo scheletrico. I chaperoni, in generale, aiutano altre proteine a “comportarsi bene”, evitando che si aggreghino in modo anomalo o aiutandole a raggiungere la loro forma corretta. HSPB7, però, è un po’ una “pecora nera” nella sua famiglia (le piccole proteine da shock termico, sHSP). A differenza delle sue parenti, non sembra formare grandi complessi oligomerici e la sua attività di chaperone generica contro l’aggregazione proteica indotta dal calore è piuttosto limitata. Sembra quasi specializzata per un compito ben preciso. E indovinate un po’? È stato osservato che interagisce proprio con il dominio d24 di FLNC! L’assenza di HSPB7, addirittura, è letale a livello embrionale nei topi, causando gravi difetti cardiaci con aggregati di FLNC.

Un Legame Svelato Sotto Pressione

La domanda sorge spontanea: cosa succede esattamente tra FLNC e HSPB7, soprattutto quando il muscolo è sotto stress? Per capirlo, abbiamo usato modelli murini di stress biomeccanico cardiaco (simulando condizioni come l’insufficienza cardiaca o l’ipertensione indotta). Ebbene, abbiamo visto cose molto interessanti!

• Interazione confermata: Esperimenti di immunoprecipitazione (una tecnica per “pescare” una proteina e vedere chi si porta dietro) hanno confermato che FLNC e HSPB7 interagiscono nel tessuto cardiaco dei topi.
• Aumento sotto stress: Sia FLNC che HSPB7 aumentano significativamente di quantità nei cuori sottoposti a stress biomeccanico. È come se la cellula dicesse: “Ok, c’è bisogno di rinforzi qui!”.
• Co-localizzazione: Utilizzando tecniche di immunofluorescenza (che colorano le proteine per vederle al microscopio), abbiamo osservato che nei cuori stressati, FLNC e HSPB7 non solo aumentano, ma si trovano spesso insieme negli stessi punti critici della cellula muscolare, come i dischi Z e i dischi intercalari, zone sottoposte a grande tensione meccanica.

Questi risultati ci dicono che l’interazione tra FLNC e HSPB7 è reale e sembra essere particolarmente importante proprio quando il cuore è sotto pressione.

La Struttura del Legame: Una Competizione Inaspettata

Ma come si legano esattamente queste due proteine? Per vederci chiaro, siamo passati a esperimenti in vitro con le proteine purificate. Abbiamo confermato che HSPB7, anche nelle sue forme troncate contenenti solo il dominio centrale ACD (α-crystallin domain), rimane prevalentemente monomerica (cioè se ne sta da sola), a differenza di altre sHSP.

Poi abbiamo messo insieme il dominio d24 di FLNC (che da solo forma omodimeri) con HSPB7 (o solo il suo dominio ACD). Risultato? Si forma un eterodimero FLNCd24-HSPB7ACD molto stabile! Utilizzando la spettrometria di massa nativa, una tecnica che permette di “pesare” i complessi proteici intatti, abbiamo visto che questo eterodimero si forma a scapito dell’omodimero di FLNC. È una competizione diretta!

Ancora più sorprendente: abbiamo misurato la forza di questo legame. L’eterodimero FLNC-HSPB7 è risultato significativamente più forte (con una costante di dissociazione, KD, nell’ordine dei nanomolari bassi, ~4-7 nM) rispetto all’omodimero di FLNC (KD ~76 nM). In pratica, HSPB7 ha una presa molto più salda su FLNC di quanto FLNC l’abbia sul suo “gemello”.

Per capire i dettagli atomici di questa interazione, abbiamo usato la cristallografia a raggi X e siamo riusciti a risolvere la struttura tridimensionale dell’eterodimero FLNCd24-HSPB7ACD. Abbiamo visto che l’interfaccia di legame coinvolge specifiche regioni di entrambe le proteine, con contatti principalmente idrofobici (come olio che si mescola con olio) e alcuni legami polari che stabilizzano ulteriormente il complesso. È importante notare che il sito di legame su FLNCd24 per HSPB7 si sovrappone quasi perfettamente a quello usato per formare l’omodimero. Questo spiega strutturalmente perché la formazione dell’uno esclude quella dell’altro. Abbiamo poi validato questa interfaccia anche in soluzione usando la spettrometria di massa con scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS), che ci ha confermato quali parti delle proteine sono protette dal solvente quando formano il complesso.

La Fosforilazione: Un Interruttore Molecolare

Le cellule hanno modi sofisticati per regolare le interazioni proteiche. Uno dei più comuni è la fosforilazione, l’aggiunta di un gruppo fosfato a specifici amminoacidi (come serina, treonina o tirosina). Abbiamo notato che proprio sull’interfaccia di dimerizzazione di FLNCd24 ci sono due siti di fosforilazione, T2677 (treonina 2677) e Y2683 (tirosina 2683), che vengono modificati in condizioni di stress cellulare, esercizio fisico o persino in alcuni tumori.

Potevano questi piccoli gruppi fosfato influenzare l’equilibrio tra omodimero ed eterodimero? Abbiamo creato delle versioni mutate di FLNCd24 che mimavano lo stato fosforilato (T2677D e Y2683E) e abbiamo rifatto i nostri esperimenti di legame. I risultati sono stati sbalorditivi!

• Fosforilazione su T2677: Questa modifica stabilizza fortemente l’omodimero di FLNC (lo rende circa 9 volte più forte!) ma, allo stesso tempo, indebolisce il legame con HSPB7 (circa 3-4 volte più debole). L’effetto netto è che, in presenza di HSPB7, la forma pT2677 di FLNC favorisce decisamente la formazione di omodimeri.
• Fosforilazione su Y2683: Qui succede l’esatto opposto! Questa modifica destabilizza drasticamente l’omodimero di FLNC (lo rende circa 50 volte più debole!) e, contemporaneamente, rafforza leggermente il legame con HSPB7. L’effetto netto è che la forma pY2683 di FLNC, in presenza di HSPB7, viene spinta potentemente verso la formazione dell’eterodimero.

Per capire il “perché” molecolare di questi effetti opposti, abbiamo usato simulazioni di dinamica molecolare (MD), che ci permettono di vedere come si muovono gli atomi nel tempo. Le simulazioni hanno rivelato come l’aggiunta del gruppo fosfato carico negativamente in T2677 crei nuovi legami favorevoli (ponti salini) nell’omodimero ma disturbi quelli nell’eterodimero. Al contrario, il fosfato su Y2683 introduce repulsioni nell’omodimero ma forma nuovi legami favorevoli con HSPB7 nell’eterodimero. È un meccanismo di regolazione incredibilmente preciso!

Un’Interazione Antica Quanto il Cuore

Questa interazione così specifica e finemente regolata tra FLNC e HSPB7 ci ha incuriosito: da quanto tempo esiste? Abbiamo fatto un’analisi filogenetica, ricostruendo la storia evolutiva di HSPB7. Abbiamo scoperto che questa proteina è presente fino ai cordati tunicati (come la Styela), animali che possiedono un cuore primitivo, ma non in organismi più antichi senza cuore come l’anfiosso. Inoltre, le caratteristiche che rendono HSPB7 monomerica sono conservate in tutte le specie in cui si trova.

Usando strumenti computazionali come AlphaFold, abbiamo simulato la competizione tra omo- ed etero-dimerizzazione per coppie FLNC:HSPB7 di diverse specie, anche di antenati estinti ricostruiti al computer. I risultati suggeriscono che la preferenza per l’eterodimero è emersa probabilmente nel ramo evolutivo che porta all’ultimo antenato comune tra tunicati e vertebrati, circa 400-500 milioni di anni fa, proprio quando si stavano evolvendo i primi cuori! E non solo: i siti di fosforilazione regolatoria T2677 e Y2683 su FLNC sono conservati in tutte queste specie, suggerendo che anche questo meccanismo di fine-tuning sia altrettanto antico.

Cosa Significa Tutto Questo?

Mettendo insieme tutti i pezzi, emerge un quadro affascinante. HSPB7 agisce come un regolatore specifico della dimerizzazione di FLNC. Poiché l’eterodimero FLNC-HSPB7 è più stabile dell’omodimero FLNC-FLNC, la presenza di HSPB7 sposta l’equilibrio, favorendo la dissociazione degli omodimeri e “cappando” i monomeri di FLNC.

Qual è la conseguenza funzionale? L’omodimero di FLNC è una struttura grande (circa 582 kDa) necessaria per reticolare l’actina, ma probabilmente poco mobile. L’eterodimero FLNC-HSPB7 è molto più piccolo (circa 310 kDa) e incapace di reticolare l’actina. Questo suggerisce che HSPB7 possa aumentare la mobilità di FLNC nella cellula. In condizioni di stress biomeccanico, dove HSPB7 aumenta, questo potrebbe permettere a FLNC di raggiungere più rapidamente i siti di danno nel citoscheletro muscolare per stabilizzarli, in attesa di riparazioni più permanenti.

La fosforilazione aggiunge un ulteriore livello di controllo. La fosforilazione in T2677 (associata a stress cardiaco) stabilizza l’omodimero, riducendo la mobilità di FLNC e rafforzando le connessioni citoscheletriche. Al contrario, la fosforilazione in Y2683 (associata a esercizio o cancro) favorisce l’eterodimero, aumentando la mobilità di FLNC, con potenziali conseguenze sia fisiologiche che patologiche. Pensate che una variante genetica umana che impedisce la fosforilazione in Y2683 è stata associata a cardiomiopatie e miopatie!

In conclusione, abbiamo svelato un meccanismo molecolare elegante e antico attraverso cui HSPB7, un chaperone atipico, regola specificamente la funzione di FLNC nel muscolo cardiaco, modulandone la capacità di dimerizzare e, probabilmente, la sua mobilità, con la fosforilazione che agisce da interruttore fine. Questo non solo ci aiuta a capire meglio come funzionano i nostri muscoli a livello fondamentale, ma apre anche nuove prospettive per comprendere e, speriamo un giorno, trattare malattie cardiache e muscolari. La danza delle proteine continua!

Fonte: Springer